Abstract Drosophila nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are ligand-gated ion channels that represent a target for insecticides. Peptide neurotoxins are known to block nAChRs by binding to their target subunits, however, a better understanding of receptor subunit composition is needed for effective design of insecticides. To facilitate the analysis of nAChRs we used a CRISPR/Cas9 strategy to generate null alleles for all ten nAChR subunit genes in a common genetic background. We studied interactions of nAChR subunits with peptide neurotoxins by larval injections and styrene maleic acid lipid particles (SMALPs) pull-down assays. For the null alleles we determined the effects of α-Bungarotoxin (α-Btx) and ω-Hexatoxin-Hv1a (Hv1a) administration, identifying potential receptor subunits implicated in the binding of these toxins. We employed pull-down assays to confirm α-Btx interactions with the D α 5, Dα6, D α 7 subunits. Finally, we report the localization of fluorescent tagged endogenous Dα6 during nervous system development. Taken together this study elucidates native Drosophila nAChR subunit interactions with insecticidal peptide toxins and provides a resource for the in vivo analysis of insect nAChRs.

The Drosophila shaggy gene (sgg, GSK-3) encodes multiple protein isoforms with serine/threonine kinase activity and is a key player in diverse developmental signalling pathways. Currently it is unclear whether different Sgg proteoforms are similarly involved in signalling or if different proteoforms have distinct functions. We used CRISPR/Cas9 genome engineering to tag eight different Sgg proteoform classes and determined their localization during embryonic development. We performed proteomic analysis of the two major proteoform classes and generated mutant lines for both of these for transcriptomic and phenotypic analysis. We uncovered distinct tissue-specific localization patterns for all of the tagged proteoforms we examined, most of which have not previously been characterised directly at the protein level, including one proteoform initiating with a non-standard codon. Collectively this suggests complex developmentally regulated splicing of the sgg primary transcript. Further, affinity purification followed by mass spectrometric analyses indicate a different repertoire of interacting proteins for the two major proteoform classes we examined, one with ubiquitous expression (Sgg-PB) and one with nervous system specific expression (Sgg-PA). Specific mutation of these proteoforms shows that Sgg-PB performs the well characterised maternal and zygotic segmentations functions of the sgg locus, while Sgg-PA mutants show adult lifespan and locomotor defects consistent with its nervous system localisation. Our findings provide new insights into the role of GSK-3 proteoforms and intriguing links with the GSK-3α and GSK-3β encoded by independent vertebrate genes. Our analysis suggests that different protein isoforms generated by alternative splicing perform distinct functions.

Abstract Recent studies have shown that hundreds of small proteins were occulted when protein coding genes were annotated. These proteins, called alternative proteins, have failed to be annotated notably due to the short length of their open reading frame (less than 100 codons) or the enforced rule establishing that messenger RNAs (mRNAs) are monocystronic. Several alternative proteins were shown to be biologically active molecules and seem to be involved in a wide range of biological functions. However, genome wide exploration of the alternative proteome is still limited to a few species. In the present article we describe a deep peptidomics workflow which enabled the identification of 401 alternative proteins in Drosophila melanogaster . Subcellular localization, protein domains and short linear motifs were predicted for 235 of the alternative proteins identified and point towards specific functions of these small proteins. Several alternative proteins had approximated abundances higher than their canonical counterparts, suggesting that these alternative proteins are actually the main products of their corresponding genes. Finally, we observed fourteen alternative proteins with developmentally regulated expression patterns and ten induced upon heat shock treatment of embryos, demonstrating stage or stress specific production of alternative proteins.

Abstract The Drosophila shaggy ( sgg ) gene encodes the major fly orthologue of Glycogen Synthase Kinase −3 (GSK-3), a key highly conserved kinase at the heart of many signalling pathways. The sgg locus is complex, encoding multiple protein isoforms that are expressed in distinct temporal and tissue-specific patterns across development. Its isoforms predominantly differ at the carboxy and amino termini due to the use of different transcriptional start sites and alternative splicing events that include internal and terminal exons. One interesting class of proteins isoforms is represented by the Sgg-PD class (Sgg46), three proteoforms that contain a large 582 amino acid N-terminal domain which contains recognition sites for caspase-mediated cleavage. Regulated cleavage at these sites by non-apoptotic caspases has previously been implicated in the regulation of Sgg activity in adult bristle development. Here, we take a genome engineering approach to introduce specific tags into this unique Sgg-PD exon and utilise these for localisation and protein interaction studies. We also generated new loss of function alleles and specific mutations in the caspase cleavage motifs. We find that loss of functions Sgg-PD class alleles are viable and fertile, but exhibit adult locomotor and bristle defects. Expression analysis of lines carrying tags on both sides of the caspase cleavage sites indicates that the cleavage is developmentally regulated during embryogenesis. Surprisingly, we found that in some cells, particularly embryonic hemocytes, the N-terminal domain released by caspase cleavage is retained while the polypeptide containing the conserved kinase domain is apparently lost. Transcriptomic analysis of embryos homozygous for the new caspase-insensitive allele indicates a role for Sgg-PD in the regulation of cytoskeletal and cell junction functions, which is supported by proteomics analysis using specific in locus tags to identify common and unique protein interaction partners with N- and C-terminal domains. Taken together, our work identifies new activities for the Sgg protein and uncovers unexpected roles for caspase cleavage in Sgg biology.