ABSTRACT The Argonaute proteins (AGO) are well-known for their essential role in post-transcriptional gene silencing in the microRNA (miRNA) biogenesis pathway. Only two AGOs (AGO1 and AGO2) are expressed in mouse embryonic stem cells (mESCs). The transcriptome of Ago mutant mESCs revealed a large and specific set of misregulated genes, compared to other miRNA biogenesis factor mutant cells, suggesting additional functions for the AGOs in stem cells. In this study, we endeavored to understand miRNA-independent roles of the AGOs in gene expression regulation through the integration of multiple datasets. Correlation of Ago mutant differential gene expression with ENCODE histone modification data of WT mESCs revealed that affected genes were regulated by the repressive histone modification H3K27me3. We validated this observation by performing chromatin immunoprecipitation followed by sequencing and observed a global loss of H3K27me3 in Ago mutant cells. Nevertheless, this reduction explains only a small part of the specific differential gene expression observed in Ago mutant mESCs. By integrating chromatin accessibility data in conjunction with prediction of transcription factor binding sites, we identified differential binding for five transcription factors, including KLF4 as a key modulator of more than half of the specific misregulation of gene expression in the absence of AGO proteins. Our findings illustrate that in addition to chromatin state, information about transcription factor binding is more revelatory in understanding the multi-layered mechanism adopted by cells to regulate gene expression. These data also highlight the importance of an integrative approach to unravel the variety of noncanonical functions of AGOs in mESCs.

ABSTRACT Argonaute proteins (AGOs), that play an essential role in cytosolic post-transcriptional gene silencing, have been also reported to function in nuclear processes like transcriptional activation or repression, alternative splicing and, chromatin organization. As most of these studies have been conducted in human cancer cell lines, the relevance of AGOs nuclear functions in the context of mouse early embryonic development remains uninvestigated. Here, we examined a possible role of the AGO1 protein on the distribution of constitutive heterochromatin in mouse Embryonic Stem Cells (mESCs). We observed a specific redistribution of the repressive histone mark H3K9me3 and the heterochromatin protein HP1α, away from pericentromeric regions upon Ago1 depletion. Furthermore, we demonstrated that major satellite transcripts are strongly upregulated in Ago1 _KO mESCs and that their levels are partially restored upon AGO1 rescue. We also observed a similar redistribution of H3K9me3 and HP1α in Drosha _KO mESCs, suggesting a role for microRNAs (miRNAs) in the regulation of heterochromatin distribution in mESCs. Finally, we showed that specific miRNAs with complementarity to major satellites can partially regulate the expression of these transcripts. Summary blurb Depletion of AGO1 in mESCs leads to a redistribution of H3K9me3 and HP1α away from pericentromeric regions and is accompanied by an upregulation of major satellites transcripts.

The development of in vitro models, which accurately recapitulate early embryonic development, is one of the fundamental challenges in stem cell research. Most of the currently employed approaches involve the culture of embryonic stem cells (ESCs) on two-dimensional (2D) surfaces. However, the monolayer nature of these cultures does not permit cells to grow and proliferate in realistic three-dimensional (3D) microenvironments, as in an early embryo. In this paper, novel 3D synthetic scaffold arrays, fabricated by two-photon polymerization photolithography, are utilized to mimic tissue-specific architecture, enabling cell-to-matrix interaction and cell-to-cell communication in vitro . Mouse ESCs (mESCs) are able to grow and proliferate on these structures and maintain their pluripotent state. Furthermore, the 3D microscaffold arrays are integrated into a microscopy slide allowing the evaluation of the expression of key pluripotency factors at the single-cell level. Comparing 2D and 3D surfaces, mESCs grown in serum+LIF on 3D microscaffolds exhibit a stronger and more homogenous expression of NANOG and OCT4 pluripotency factors, than cells cultivated in 2i media, demonstrating that 3D microscaffolds capture naive pluripotency in vitro . Thus, the slide affords a novel and unique tool to model and study mammalian early development with greater physiological relevance than conventional 2D cultures.