Histone acetylation and phosphorylation have separately been suggested to affect chromatin structure and gene expression. Here we report that these two modifications are synergistic. Stimulation of mammalian cells by epidermal growth factor (EGF) results in rapid and sequential phosphorylation and acetylation of H3, and these dimodified H3 molecules are preferentially associated with the EGF-activated c-fos promoter in a MAP kinase-dependent manner. In addition, the prototypical histone acetyltransferase Gcn5 displays an up to 10-fold preference for phosphorylated (Ser-10) H3 over nonphosphorylated H3 as substrate in vitro, suggesting that H3 phosphorylation can affect the efficiency of subsequent acetylation reactions. Together, these results illustrate how the addition of multiple histone modifications may be coupled during the process of gene expression.

Histone methylation is known to be associated with both transcriptionally active and repressive chromatin states. Recent studies have identified SET domain–containing proteins such as SUV39H1 and Clr4 as mediators of H3 lysine 9 (Lys9) methylation and heterochromatin formation. Interestingly, H3 Lys9 methylation is not observed from bulk histones isolated from asynchronous populations of Saccharomyces cerevisiae or Tetrahymena thermophila . In contrast, H3 lysine 4 (Lys4) methylation is a predominant modification in these smaller eukaryotes. To identify the responsible methyltransferase(s) and to gain insight into the function of H3 Lys4 methylation, we have developed a histone H3 Lys4 methyl-specific antiserum. With this antiserum, we show that deletion of SET1 , but not of other putative SET domain–containing genes, in S. cerevisiae , results in the complete abolishment of H3 Lys4 methylation in vivo. Furthermore, loss of H3 Lys4 methylation in a set1 Δ strain can be rescued by SET1 . Analysis of histone H3 mutations at Lys4 revealed a slow-growth defect similar to a set1 Δ strain. Chromatin immunoprecipitation assays show that H3 Lys4 methylation is present at the rDNA locus and that Set1-mediated H3 Lys4 methylation is required for repression of RNA polymerase II transcription within rDNA. Taken together, these data suggest that Set1-mediated H3 Lys4 methylation is required for normal cell growth and transcriptional silencing.

DNA in eukaryotic cells is associated with histone proteins; hence, hallmark properties of apoptosis, such as chromatin condensation, may be regulated by posttranslational histone modifications. Here we report that phosphorylation of histone H2B at serine 14 (S14) correlates with cells undergoing programmed cell death in vertebrates. We identify a 34 kDa apoptosis-induced H2B kinase as caspase-cleaved Mst1 (mammalian sterile twenty) kinase. Mst1 can phosphorylate H2B at S14 in vitro and in vivo, and the onset of H2B S14 phosphorylation is dependent upon cleavage of Mst1 by caspase-3. These data reveal a histone modification that is uniquely associated with apoptotic chromatin in species ranging from frogs to humans and provide insights into a previously unrecognized physiological substrate for Mst1 kinase. Our data provide evidence for a potential apoptotic “histone code.”

Article17 September 2001free access Specificity of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus of histone H3 Steven A. Jacobs Steven A. Jacobs Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA Search for more papers by this author Sean D. Taverna Sean D. Taverna Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA Search for more papers by this author Yinong Zhang Yinong Zhang Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Scott D. Briggs Scott D. Briggs Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Jinmei Li Jinmei Li Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Joel C. Eissenberg Joel C. Eissenberg Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA Search for more papers by this author C. David Allis C. David Allis Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Sepideh Khorasanizadeh Corresponding Author Sepideh Khorasanizadeh Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Steven A. Jacobs Steven A. Jacobs Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA Search for more papers by this author Sean D. Taverna Sean D. Taverna Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA Search for more papers by this author Yinong Zhang Yinong Zhang Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Scott D. Briggs Scott D. Briggs Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Jinmei Li Jinmei Li Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Joel C. Eissenberg Joel C. Eissenberg Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA Search for more papers by this author C. David Allis C. David Allis Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Sepideh Khorasanizadeh Corresponding Author Sepideh Khorasanizadeh Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA Search for more papers by this author Author Information Steven A. Jacobs1,2, Sean D. Taverna1,2, Yinong Zhang1, Scott D. Briggs1, Jinmei Li1, Joel C. Eissenberg2, C. David Allis1 and Sepideh Khorasanizadeh 1 1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia Health System, Charlottesville, VA, 22908 USA 2Edward A.Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 1402 South Grand Boulevard, St Louis, MO, 63104 USA ‡S.A.Jacobs and S.D.Taverna contributed equally to this work *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2001)20:5232-5241https://doi.org/10.1093/emboj/20.18.5232 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Recent studies show that heterochromatin-associated protein-1 (HP1) recognizes a ‘histone code’ involving methylated Lys9 (methyl-K9) in histone H3. Using in situ immunofluorescence, we demonstrate that methyl-K9 H3 and HP1 co-localize to the heterochromatic regions of Drosophila polytene chromosomes. NMR spectra show that methyl-K9 binding of HP1 occurs via its chromo (chromosome organization modifier) domain. This interaction requires methyl-K9 to reside within the proper context of H3 sequence. NMR studies indicate that the methylated H3 tail binds in a groove of HP1 consisting of conserved residues. Using fluorescence anisotropy and isothermal titration calorimetry, we determined that this interaction occurs with a KD of ∼100 μM, with the binding enthalpically driven. A V26M mutation in HP1, which disrupts its gene silencing function, severely destabilizes the H3-binding interface, and abolishes methyl-K9 H3 tail binding. Finally, we note that sequence diversity in chromo domains may lead to diverse functions in eukaryotic gene regulation. For example, the chromo domain of the yeast histone acetyltransferase Esa1 does not interact with methyl- K9 H3, but instead shows preference for unmodified H3 tail. Introduction It is now recognized that heritable changes in gene expression can occur without changes in gene DNA sequence. Elegant studies in Drosophila have provided insights into an epigenetic phenomenon known as position effect variegation (PEV) (Spofford, 1976; Eisseberg, 1989; Weiler and Wakimoto, 1995). Through rearrangement or transposition from its normal euchromatic position to one in the vicinity of heterochromatin, the ‘on/off’ state of a particular gene can be altered, resulting in PEV or mosaic silencing. Heterochromatin regions classically are observed as chromocenters of polytene chromosomes found in salivary glands of Drosophila (Figure 1C). Importantly, a group of dominant suppressors of PEV has been identified that are referred to collectively as Su(var) genes. For example, heterochromatin protein 1 (HP1) was first identified in Drosophila as Su(var)2-5 (James and Elgin, 1986; Eissenberg et al., 1990). HP1 proteins have been reported in organisms as diverse as fission yeast (Swi6p) and mammals (HP1α, β and γ) (Eissenberg and Elgin, 2000), with a conserved role in epigenetic control of heterochromatin assembly that has recently been characterized (Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001). In the absence of HP1, multiple telomere—telomere fusions occur, resulting in a striking spectrum of abnormal chromosomal configurations (Fanti et al., 1998). Figure 1.A specific antibody for methyl-K9 H3, α-methyl-K9 H3, co-localizes with HP1 in polytene chromosomes. (A) ELISA analysis of α-methyl-K9 H3 showing specificity of the antiserum for methyl-K9 H3 peptide. The α-methyl-K9 H3 antibody was produced by using a methyl-lysine-containing H3 sequence, TARKSTGGC, coupled to keyhole limpet hemocyanin (KLH). (B) Western analysis (12% SDS—PAGE) of recombinant Xenopus H3 (rX.l. H3) (gift from K.Luger), human core histones (hMCF7) and Drosophila core histones (dS2) using α-methyl-K9 H3. The right lane of the two dS2 lanes corresponds to the experiment where antibodies were pre-absorbed with methyl-K9 H3 peptide. (C–E) Third instar polytene chromosomes were analyzed by indirect immunofluoresence using the general DNA stain DAPI (C), α-methyl-K9 H3 (D) and anti-HP1 antibodies, α-HP1 (E). The white arrows point to chromocenters. Download figure Download PowerPoint Chromatin structure and function can be influenced by distinct patterns of post-translational modification within histone tails (Turner, 2000; Wolffe and Guschin, 2000). The ‘histone code’ hypothesis suggests that multiple histone modifications, acting in a combinatorial or sequential fashion on one or multiple histone tails, specify unique functions along the eukaryotic genome (Strahl and Allis, 2000). In some cases, subunits of transcriptional regulators contain one or multiple bromodomains that recognize histone tails acetylated on lysines normally required for active transcription (Dhalluin et al., 1999; Hudson et al., 2000; Jacobson et al., 2000; Owen et al., 2000). Methylation of specific lysines on histone H3 has also been reported (Ohe and Iwai, 1981; Strahl et al., 1999). In this regard, human SUV39H1 and Schizo saccharomyces pombe Clr4, two SET domain-containing homologs of Drosophila Su(var)3-9, have been identified to be histone methyltransferases that specifically methylate Lys9 of histone H3 (Rea et al., 2000; Nakayama et al., 2001; for reviews see Jenuwein, 2001; Rice and Allis, 2001). Very recently, a series of in vitro pull-down assays showed that methylated Lys9 on histone H3 (methyl-K9 H3) might be a molecular handle for the chromo domain of HP1 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). In particular, Bannister et al. showed that the HP1 association with methylated mononucleosomes could be completely disrupted by the addition of excess methyl-K9 H3 peptide, suggesting that HP1 recognizes methyl-K9 H3 in the context of mononucleosomes. Pull-down assays have also indicated that the HP1 chromo domain interacts with the histone fold domain of H3, suggesting that there may be additional sites of interaction between the chromo domain and H3 (Nielsen et al., 2001). HP1 interaction with methyl-K9 H3 is essential for epigenetic control of heterochromatin assembly in vivo (Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001). In our study, we have focused on elucidating the specificity of methyl-K9 recognition using a series of H3 tail peptides described in Materials and methods. Here, we use Drosophila HP1 as a model to characterize HP1 specificity for the H3 tail. Using an antibody specific for methyl-K9 H3, we show that this methylation ‘histone code’ and HP1 protein co-localize in situ on Drosophila polytene chromosome squashes. Through in vitro studies by NMR spectroscopy, fluorescence anisotropy and isothermal titration calorimetry, we characterize the physical determinants of this interaction and map the binding interface. In addition, we use similar in vitro studies to address the significance of point mutations that abolish (V26M) and alter (Y24F) gene silencing function of HP1 in vivo. The physical interactions described here for Drosophila HP1 may serve as general determinants of the specificity of HP1 chromo domains for the methylated H3 tail. However, sequence diversity observed in non-HP1 chromo domains may enable them to achieve different types of chromatin docking interactions. In support, we show that the chromo domain of Esa1 histone acetyltransferase does not interact with the methyl-K9 H3 tail, but it has avidity for the unmodified H3 tail. Results In vivo binding studies To detect patterns of H3 K9 methylation in vivo, we generated an antibody that specifically recognizes methylated K9 of histone H3. Microsequencing and mass spectrometry data indicate that the dimethylated form of a single lysine predominates in histone H3 in vivo (Borun et al., 1972; Duerre and Chakrabarty, 1975; Strahl et al., 1999). Therefore, a synthetic peptide containing this form of lysine modification was used to generate a polyclonal antibody in rabbits. The specificity of the resulting antiserum (hereafter referred to as α-methyl-K9 H3) was assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). As shown in Figure 1A, α-methyl- K9 H3 recognized methyl-K9 H3 peptide with little cross-reactivity to control peptides, methyl-K4 H3 or unmodified H3. Addition of methyl-K9 H3 peptide to α-methyl-K9 H3 prior to the ELISA abolished recognition of methyl-K9 H3. By comparison, in a parallel control, the same concentration of methyl-K4 H3 peptide did not block recognition of the methyl-K9 H3 peptide. Together, these data demonstrate that α-methyl-K9 H3 specifically recognizes methylated K9 in the context of the H3 tail. To investigate the in vivo presence of methyl-K9 H3 in Drosophila and human cells, whole-cell extracts were examined by western blot analysis using α-methyl-K9 H3. Histone-enriched extracts were made from MCF7 (human) and S2 (Drosophila) cell lines, and equal amounts of protein were immunoblotted with α-methyl-K9 H3, which showed that methyl-K9 H3 was present in both extracts (Figure 1B). As a negative control, recombinant histone H3 was not detected by α-methyl-K9 H3. Pre-absorption with methyl-K9 H3 peptide abolished α-methyl-K9 H3 recognition of H3, whereas reactivity was not lost with pre-absorption with methyl-K4 H3 peptide (data not shown). These results indicate that K9 methylation occurs in both human and Drosophila H3, and can be detected successfully by our antibody. To investigate the in vivo significance of HP1 recognition of methyl-K9 H3 in Drosophila, we probed polytene chromosome squashes with α-methyl-K9 H3 antibodies, and detected a chromocentric staining pattern (Figure 1D). This pattern of staining co-localized with α-HP1 staining, suggesting that methyl-K9 H3 and HP1 both reside at the chromocenters (Figure 1D and E). As with ELISA and western analysis, pre-absorption with methyl-K9 H3 peptide was able to ablate α-methyl-K9 H3 specificity, while antisera pre-absorbed with methyl-K4 H3 peptide still exhibited chromocentric staining. In vitro binding studies The HP1 family of proteins (Eissenberg and Elgin, 2000) have an N-terminal chromo domain and a related C-terminal chromo shadow domain. The chromo domain is also present in the Drosophila Polycomb protein, which represses expression of homeotic genes. The chromo domain consists of a monomeric three-stranded antiparallel β-sheet that is flanked by a C-terminal α-helix (Ball et al., 1997; Horita et al., 2001). The chromo shadow domain is dimeric, and consists of a three-stranded antiparallel β-sheet that is flanked by two C-terminal α-helices, which form the symmetric dimer interface (Brasher et al., 2000). We prepared recombinant constructs of intact HP1, chromo and chromo shadow domains, and collected the corresponding fingerprint [1H—15N]-HSQC NMR spectra. In agreement with studies on mammalian HP1β (Brasher et al., 2000), we find, using gel filtration studies, that the intact protein and the chromo shadow domain are dimeric, whereas the chromo domain is monomeric. As shown in Figure 2A, each set of the chromo and chromo shadow domain resonances superimposes remarkably well on the spectrum of the intact protein. These data demonstrate that the chromo and chromo shadow domains are independent of each other within the intact protein while tethered via their 50 residue flexible linker, and that these two domains do not interact significantly within the context of the intact protein. Figure 2.Two-dimensional [15N—1H]-HSQC NMR spectra demonstrating the specific interaction of the HP1 chromo domain with methyl-K9 H3 peptide. (A) Superposition of the chromo (amino acids 1–84 in green cross-peaks) and chromo shadow (amino acids 132–206 in red cross-peaks) domains spectra on the intact HP1 (amino acids 1–206 in black cross-peaks). In order to improve the NMR spectra of the chromo shadow domain (20 kDa dimer) and intact (50 kDa dimer) proteins, we incorporated 50% perdeuteration of non-labile hydrogens in the samples. This was achieved by growing E.coli in the media containing 50% D2O–50% H2O. (B) Superposition of the chromo domain free (black cross-peaks) and in complex with methyl-K9 H3 peptide (red cross-peaks); stoichiometric binding was achieved at the protein to peptide concentration ratio of 1:4. (C) Superposition of the chromo domain free (black cross-peaks) and in the presence of saturating amount of methyl-K4 H3 peptide (red cross-peaks). Download figure Download PowerPoint We then collected NMR spectra of HP1 in the presence of H3 tail peptides. No chemical shift changes in HP1 were detected when the unmodified H3 tail was used. In contrast, chemical shift perturbations were detected only for the chromo domain upon addition of methyl-K9 (very large shifts) and methyl-K4 (insignificant shifts) H3 peptides. Figure 2B and C shows the spectra for the chromo domain in the presence of saturating amounts of each modified peptide. Incidentally, titration of methyl-K9 H3 peptides corresponding to residues 1–15 and 1–20 of histone H3 showed exactly the same pattern of chemical shift perturbation, suggesting that H3 residues 15–20 do not contribute to binding. When we titrated methylated lysine amino acids alone (monomethyl, dimethyl and trimethyl forms of H-Lys-OH) to final protein:amino acid ratios of 1:10, no changes in the HSQC spectrum of the chromo domain were detected. This implies that methyl-lysine is only recognized by HP1 when it is presented in the context of the H3 tail sequence. We carried out solution binding studies, and found that a weak binding interaction occurs between the HP1 chromo domain and the methyl-K9 H3 tail. Fluorescence anisotropy studies indicate that the intact protein and the chromo domain have similar dissociation constants (KD of ∼100 μM, Figure 3; Table I). Therefore, the chromo domains of the dimeric intact protein are independent of each other, and are each able to bind the peptide in a 1:1 complex, a finding in close agreement with the NMR data shown in Figure 2A. Moreover, using this assay, we show that methyl-K4 H3 tail interacts very weakly (KD = 1.9 ± 0.5 mM) while the unmodified H3 tail does not interact with the chromo domain (Figure 3). In addition, an H3 tail containing both methyl-K4 and methyl-K9 modifications can still bind with a 2.5-fold weaker affinity (KD = 268 ± 25 μM) than that containing only methyl-K9 modification. Figure 3.Binding of the HP1 chromo domain to fluorescein-labeled H3 tail peptides as measured by fluorescence polarization. Curves represent the best fit to the data as described in Materials and methods. The fraction bound corresponds to the normalized anisotropy. Binding assays were performed for the HP1 chromo domain with unmodified H3 (triangles), methyl-K9 H3 (circles), methyl-K4 H3 (crosses) and methyl-K4/methyl-K9 H3 (diamonds). The binding assay performed for intact HP1 with methyl-K9 H3 is shown with squares. Download figure Download PowerPoint Table 1. Thermodynamic parameters involved in interaction of Drosophila HP1 with methyl-K9 H3 peptide Temperature (°C) KD (fluorescence μM) KD (ITC μM) ΔH (ITC kcal/mol) N (ITC) ΔG (kcal/mol) TΔS (kcal/mol) 25 120 ± 12 105 ± 24 −11.7 ± 2.4 0.90 ± 0.11 −5.4 −6.3 (133 ± 11) 15 80 ± 8 59 ± 8 −10.6 ± 0.5 0.96 ± 0.02 −5.6 −5.0 (91 ± 5) Binding results were obtained from fluorescence anisotropy (fluorescence) and isothermal titration calorimetry (ITC). Fluorescence anisotropy of the fluorescein-labeled peptide was used to determine the apparent dissociation constant KD (when a 1:1 binding stoichiometry is assumed) for the chromo domain and intact HP1 (values in parentheses) at 15 and 25°C. Using ITC, the single site binding constant KD, the heat of binding ΔH and the number of sites N were independently measured variables at 15 and 25°C. The free energy and entropy changes for binding were then calculated using the following relationships: ΔG = −RT ln KD and ΔG = ΔH − TΔS, respectively. In each case, parameters are reported as the mean (± average deviation from the mean) obtained from two independent titration experiments. Using isothermal titration calorimetry (ITC), we have obtained additional thermodynamic parameters that characterize the interaction of the chromo domain with methyl-K9 H3 tail. By titrating the peptide into the chromo domain sample, we find that the binding is exothermic and has a large enthalpic contribution (ΔH = −11.6 kcal/mol at 25°C; Figure 4). Binding also has a modest Gibbs free energy (ΔG = −5.4 kcal/mol) that is consistent with the small cost in entropy (TΔS = −6.3 kcal/mol). Therefore, burial of the polar surface is probably important for binding. In support, when fluorescence binding assays were performed under destabilizing conditions for polar interactions (0.5 M NaCl was added to the buffer), the affinity dropped 4-fold (KD = 396 ± 60 μM). In contrast, when binding assays were performed under stabilizing conditions for basic interactions (the pH was raised from 6 to 8), a 2-fold enhancement was detected (KD = 55 ± 7 μM) (data not shown). Figure 4.Binding of the HP1 chromo domain to methyl-K9 H3 peptide as measured by isothermal titration calorimetry at 25°C. (A) Raw data for injections of the peptide into the chromo domain as described in Materials and methods. The asterisk corresponds to the first injection, which was excluded from the analysis. (B) Integrated heats of injections, with the solid line corresponding to the best fit of the data using the MicroCal software. Download figure Download PowerPoint ITC studies show that binding is more exothermic at higher temperature, and comparison of average ΔHs at 25 and 15°C suggests a small negative ΔCp of association (−0.12 kcal/mol; although within the experimental error of ΔHs). This result is qualitatively in agreement with the idea that binding probably occurs in the absence of significant conformational changes in the protein, and that there is a decrease in exposure of hydrophobic groups to water when the complex forms. By comparison, interaction of the SH2 module with phosphotyrosyl peptide has a ΔCp of −0.1 kcal/mol, and peptide binding occurs with minimal conformational rearrangements (for a review see Kuriyan and Cowburn, 1997). Nature of the binding interface In order to identify the chromo domain surface of interaction with methyl-K9 H3 tail, we collected a series of three-dimensional NMR spectra (see Materials and methods) and determined the sequential assignment for the free and complex forms. Upon completing the assignment, we noted that a number of backbone nuclei show unusually large chemical shift perturbations upon methyl-K9 H3 binding (Figure 2B). Figure 5A illustrates the weighted average chemical shift difference, Δδave, for each amino acid upon methyl-K9 H3 peptide binding calculated by using the relationship 0.25[(ΔHN)2 + (ΔN/5)2 + (ΔC′/2)2 + (ΔCα/2)2]1/2, where Δi is the chemical shift difference for resonance i in the free and complexed states (Grzesiek et al., 1996). The resulting chemical shift perturbations are consistent with the formation of a specific complex in which only selected residues participate in peptide binding. The chemical shift changes in the 13C′ and 13Cα resonances do not result in changes in the secondary structure elements, as judged by the chemical shift index analysis and the analysis of the nuclear Overhauser effect (NOE; data not shown). Figure 5.NMR-detected differences between the complex (with methyl-K9 H3 peptide) and free chromo domain. (A) Backbone chemical shift differences between the chromo domain bound to methyl-K9 H3 peptide and free chromo domain are tabulated in the form of weighted average chemical shift difference, Δδave, as described in the text; the asterisks correspond to the sites with no available data. Secondary structure elements are shown at the top. (B) 15N relaxation data measured at 60.8 MHz for 1 mM free (triangles) and complex (circles) chromo domain. Download figure Download PowerPoint The {1H}—15N NOE values for the backbone 15N nuclei in the free and complex forms of the chromo domain are shown in Figure 5B. The {1H}—15N NOE values are influenced by the internal dynamics of individual amides as well as the overall rotational diffusion of the protein (Kay et al., 1989). In the free protein, the central portion of the polypeptide (region of {1H}—15N NOE ∼0.8) has restricted internal motion indicative of a highly defined structure, with the exception of the mobile turn region that connects β3 to the α-helix. In contrast, residues 1–24 and 76–82 at the N- and C-termini ({1H}—15N NOE ≤0.5) are under substantial motion lacking a well-defined structure. Upon complex formation with the peptide, the protein shows essentially no change in the pattern and quantity of {1H}—15N NOE values. However, the turn connecting β3 to the α-helix adopts a new pattern of mobility at residues 62 and 63, consistent with implicating this region in H3 tail recognition. Overall, these results imply that structural perturbations caused by peptide binding in the core region of the chromo domain are minimal, and in close agreement with the small ΔCp of binding measured by calorimetry. To map the peptide-binding surface, we relied on the existing three-dimensional structure of the 70% identical chromo domain from mammalian HP1β (Ball et al., 1997). Figure 6B and C illustrates the sites of chemical shift perturbations with Δδave ≥0.2 caused by methyl-K9 H3 peptide binding. This analysis suggests that a concave binding interaction surface exists only on one face of the β-sheet that is not comprised of residues in contiguous primary sequence (Figure 6A). The floor of this concave surface is formed by conserved hydrophobic residues L43 and W45. In addition, the electrostatic charge distribution at the methyl-K9-binding surface of HP1 is shown in Figure 6D. A region of negatively charged surface, generated by conserved residues E56 and D62, surrounded by highly conserved residues Y24, V26, L43, W45 and C63, coincides with the NMR-detected site of interaction shown in Figure 6C. The side chain of the methylated lysine residue in the H3 tail contains a positive charge with the two methyl groups. These may form favorable interactions near the L43/W45 dip of the chromo domain. Methyl-K9 and methyl-K4 modifications occur in the context of different primary sequences (RTKQT for K4 versus ARKST for K9), which are probably very important for their recognition by different chromatin-regulating factors. Figure 6.Map of the binding surface of the chromo domain for methyl-K9 H3 peptide. (A) The amino acid sequence of the Drosophila HP1 (dmHP1) chromo domain (as prepared for this study) is shown in an alignment (using CLUSTALW) with other chromo domains: human HP1 types α, β and γ, S.pombe Swi6p (amino acids 59–145), Clr4 (amino acids 1–72), human MOF (amino acids 370–456) and S.cerevesiae Esa1 (amino acids 11–97). Secondary structure elements present in dmHP1 are marked. Residues that participate in peptide binding are marked by magenta triangles. Residues in red correspond to the sites of phosphorylation in dmHP1. The boxed sequence in HP1β corresponds to the range of the three-dimensional structure of the core of this chromo domain (Ball et al., 1997) that is used to prepare (B)–(D). (B and C) Two surface views of the HP1 chromo domain related by 180° rotation. The magenta surface corresponds to residues demonstrating large perturbations, Δδave ≥0.2 (Figure 5A). (D) The surface electrostatic potential for the methyl-lysine-binding face. The residue numbers corresponding to magenta regions in (C) are labeled. In addition, residues L43, W45 and E56 were labeled in the putative binding pocket. (B)–(D) were prepared using GRASP (Nicholls, 1993). Download figure Download PowerPoint Characterization of mutants that affect the gene silencing function of HP1 A natural missense variant of Drosophila HP1, V26M, was shown to disrupt its gene silencing function (Platero et al., 1995). As shown in Figure 6, V26 is an extremely conserved residue that is implicated at the surface of the chromo domain for binding methyl-K9 H3 tail. We carried out fluorescence binding assays for the V26M chromo domain, and found that methyl-K9 H3 binding is completely ablated (Figure 7A). If we assume that the overall structure of the V26M variant is similar to that of the wild-type (the elution profile from the size-exclusion Superdex 75 column is identical to that of the wild-type), then an explanation for the abolished binding may be that a bulkier methionine at the interface of H3 tail binding (Figure 6D) precludes the packing of methyl-K9 on the chromo domain. However, analysis of the [1H—15N]-HSQC spectrum of the mutant led to the conclusion that the structure of the V26M chromo domain is severely destabilized (Figure 7B). This is indicated by the heavy amount of chemical exchange detected for the backbone amides of a set of non-contiguous residues surrounding the site of the mutation. The backbone amide signals disappear on the HSQC spectrum, indicative of structural heterogeneity at the putative surface of interaction for methyl-K9 H3 (Figure 7B). Moreover, significant chemical shift perturbations occur in regions distant from the site of mutation. These findings emphasize that a well-defined surface of the HP1 chromo domain is necessary for the recognition of the H3 tail. Figure 7.Effect of point mutations in the specificity of the HP1 chromo domain for methyl-K9 H3 peptide. (A) Fluorescence polarization assays are illustrated for wild-type (circles), V26M (squares) and Y24F/A25P (triangles); measurements w

Posttranslational histone modifications participate in modulating the structure and function of chromatin. Promoters of transcribed genes are enriched with K4 trimethylation and hyperacetylation on the N-terminal tail of histone H3. Recently, PHD finger proteins, like Yng1 in the NuA3 HAT complex, were shown to interact with H3K4me3, indicating a biochemical link between K4 methylation and hyperacetylation. By using a combination of mass spectrometry, biochemistry, and NMR, we detail the Yng1 PHD-H3K4me3 interaction and the importance of NuA3-dependent acetylation at K14. Furthermore, genome-wide ChIP-Chip analysis demonstrates colocalization of Yng1 and H3K4me3 in vivo. Disrupting the K4me3 binding of Yng1 altered K14ac and transcription at certain genes, thereby demonstrating direct in vivo evidence of sequential trimethyl binding, acetyltransferase activity, and gene regulation by NuA3. Our data support a general mechanism of transcriptional control through which histone acetylation upstream of gene activation is promoted partially through availability of H3K4me3, "read" by binding modules in select subunits.

Abstract The NuA3 complex is a major regulator of gene transcription and the cell cycle in yeast. Five core subunits are required for complex assembly and function, but it remains unclear how these subunits interact to form the complex. Here, we report that the Taf14 subunit of the NuA3 complex binds to two other subunits of the complex, Yng1 and Sas3, and describe the molecular mechanism by which the extra-terminal domain of Taf14 recognizes the conserved motif present in Yng1 and Sas3. Structural, biochemical, and mutational analyses show that two motifs are sandwiched between the two extra-terminal domains of Taf14. The head-to-toe dimeric complex enhances the DNA binding activity of Taf14, and the formation of the hetero-dimer involving the motifs of Yng1 and Sas3 is driven by sequence complementarity. In vivo assays in yeast demonstrate that the interactions of Taf14 with both Sas3 and Yng1 are required for proper function of the NuA3 complex in gene transcription and DNA repair. Our findings suggest a potential basis for the assembly of three core subunits of the NuA3 complex, Taf14, Yng1 and Sas3.

ABSTRACT BACKGROUND DNA methylation dynamics in the brain are associated with normal development and neuropsychiatric disease and differ across functionally distinct brain regions. Previous studies of genome-wide methylation differences among human brain regions focused on limited numbers of individuals and one to two brain regions. RESULTS Using GTEx samples, we have generated a resource of DNA methylation in purified neuronal nuclei from 8 brain regions as well as lung and thyroid tissues from 12-23 donors. We identified differentially methylated regions between brain regions (DMRs) among neuronal nuclei in both CpG (181,146) and non-CpG (264,868) contexts, few of which were unique to a single pair-wise comparison. This significantly expands the knowledge of differential methylation across the brain by 10-fold. In addition, we present the first differential methylation analysis among neuronal nuclei from basal ganglia tissues and identified 2,295 unique CpG DMRs, many associated with ion transport. Consistent with prior studies, CpG DMRs were enriched in regulatory regions while non-CpG DMRs were enriched in intergenic regions. We also identified 81,130 regions of variably CpG methylated regions (VMRs), i.e. variable methylation among individuals in the same brain region, which were enriched in regulatory regions and in CpG DMRs. Many VMRs were unique to a specific brain region, with only 202 common across all brain regions, as well as lung and thyroid. VMRs identified in the amygdala, anterior cingulate cortex, and hippocampus were enriched for heritability of schizophrenia. CONCLUSIONS These data suggest that epigenetic variation in these particular human brain regions could be associated with the risk for this neuropsychiatric disorder.

Abstract Chronic pain is a significant public health issue that is often refractory to existing therapies. Here we use a multiomic approach to identify cis-regulatory elements that show differential chromatin accessibility, and reveal transcription factor (TF) binding motifs with functional regulation in the dorsal root ganglion (DRG), which contain cell bodies of primary sensory neurons, after nerve injury. We integrated RNA-seq to understand how differential chromatin accessibility after nerve injury may influence gene expression. Using TF protein arrays and chromatin immunoprecipitation-qPCR, we confirmed C/EBPγ binding to a differentially accessible sequence and used RNA-seq to identify processes in which C/EBPγ plays an important role. Our findings offer insights into TF motifs that are associated with chronic pain. These data show how interactions between chromatin landscapes and TF expression patterns may work together to determine gene expression programs in DRG neurons after nerve injury.

The ciliate protozoan Tetrahymena thermophila contains two types of structurally and functionally differentiated nuclei: the transcriptionally active somatic macronucleus (MAC) and the transcriptionally silent germ-line micronucleus (MIC). Here we demonstrate that MAC features well-positioned nucleosomes downstream of transcription start sites (TSS) likely connected with promoter proximal pausing of RNA polymerase II, as well as in exonic regions flanking both the 5′ and 3′ splice sites. In contrast, nucleosomes in MIC are more delocalized. Nucleosome occupancy in MAC and MIC are nonetheless highly correlated with each other and with predictions based upon DNA sequence features. Arrays of well-positioned nucleosomes are often correlated with GC content oscillations, suggesting significant contributions from cis-determinants. We propose that cis- and trans-determinants may coordinately accommodate some well-positioned nucleosomes with important functions, driven by a process in which positioned nucleosomes shape the mutational landscape of associated DNA sequences, while the DNA sequences in turn reinforce nucleosome positioning.

Pain is a subjective experience derived from complex interactions among biological, environmental, and psychosocial pathways. Sex differences in pain sensitivity and chronic pain prevalence are well established. However, the molecular causes underlying these sex dimorphisms are poorly understood particularly with regard to the role of the peripheral nervous system. Here we sought to identify shared and distinct gene networks functioning in the peripheral nervous systems that may contribute to sex differences of pain after nerve injury. We performed RNA-seq on dorsal root ganglia following chronic constriction injury of the sciatic nerve in male and female rats. Analysis from paired naive and injured tissues showed that 1456 genes were differentially expressed between sexes. Appreciating sex-related gene expression differences and similarities in neuropathic pain models may help to improve the translational relevance to clinical populations and efficacy of clinical trials of this major health issue.