ABSTRACT The rapid identification of antimicrobial resistance is essential for effective treatment of highly resistant Mycobacterium tuberculosis . Whole-genome sequencing provides comprehensive data on resistance mutations and strain typing for monitoring transmission, but unlike for conventional molecular tests, this has previously been achievable only from cultures of M. tuberculosis . Here we describe a method utilizing biotinylated RNA baits designed specifically for M. tuberculosis DNA to capture full M. tuberculosis genomes directly from infected sputum samples, allowing whole-genome sequencing without the requirement of culture. This was carried out on 24 smear-positive sputum samples, collected from the United Kingdom and Lithuania where a matched culture sample was available, and 2 samples that had failed to grow in culture. M. tuberculosis sequencing data were obtained directly from all 24 smear-positive culture-positive sputa, of which 20 were of high quality (>20× depth and >90% of the genome covered). Results were compared with those of conventional molecular and culture-based methods, and high levels of concordance between phenotypical resistance and predicted resistance based on genotype were observed. High-quality sequence data were obtained from one smear-positive culture-negative case. This study demonstrated for the first time the successful and accurate sequencing of M. tuberculosis genomes directly from uncultured sputa. Identification of known resistance mutations within a week of sample receipt offers the prospect for personalized rather than empirical treatment of drug-resistant tuberculosis, including the use of antimicrobial-sparing regimens, leading to improved outcomes.

Whole-genome sequencing of pathogenic organisms directly from clinical samples combines 12 detection and genotyping in one step. This can speed up diagnosis, especially for slow-growing 13 organisms like Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which need considerable time to grow in 14 subculture, and can provide vital information for effective personalised treatment. Within the 15 PATHSEEK project, we have developed a bait-capture approach to selectively enrich DNA/RNA from 16 specific bacterial and viral pathogens present in clinical samples. Here, we present a variation of the 17 method that allows enrichment of large fragments of target DNA for sequencing on an Oxford 18 Nanopore MinION sequencer. We enriched and sequenced cDNA from Influenza A (FluA), genomic 19 DNA (gDNA) from human cytomegalovirus (CMV) and from two strains of Mtb, and present an 20 evaluation of the method together with analysis of the sequencing results from a MinION and an 21 Illumina MiSeq sequencer. While unenriched FluA and CMV samples had no reads matching the 22 target organism due to the high background of DNA from host cell lines, enriched samples had 56.7% 23 and 90.9% on-target reads respectively for the best quality Nanopore reads.

Inherited retinal dystrophies comprise a clinically complex and heterogenous group of diseases characterized by visual impairment due to pathogenic variants of over 300 different genes. Accurately identifying the causative gene and associated variant is crucial for the definitive diagnosis and subsequent selection of precise treatments. Consequently, well-validated genetic tests are required in the clinical practice. Here, we report the analytical and clinical validation of a next-generation sequencing targeted gene panel, the PrismGuide IRD Panel System. This system enables comprehensive genome profiling of 82 genes related to inherited retinal dystrophies. The PrismGuide IRD Panel System demonstrated 100% ( n = 43) concordance with Sanger sequencing in detecting single-nucleotide variants, small insertions, and small deletions in the target genes and also in assessing their zygosity. It also identified copy-number loss in four out of five cases. When assessing precision, we evaluated the reproducibility of variant detection with 2,160 variants in 144 replicates and found 100% agreement in terms of single-nucleotide variants ( n = 1,584) and small insertions and deletions ( n = 576). Furthermore, the PrismGuide IRD Panel System generated sufficient read depth for variant calls across the purine-rich and highly repetitive open-reading frame 15 region of RPGR and detected all five variants tested. These results show that the PrismGuide IRD Panel System can accurately and consistently detect single-nucleotide variants and small insertions and deletions. Thus, the PrismGuide IRD Panel System could serve as useful tool that is applicable in clinical practice for identifying the causative genes based on the detection and interpretation of variants in patients with inherited retinal dystrophies and can contribute to a precise molecular diagnosis and targeted treatments.