Significance DNA transposons that translocate by excision from a donor site and insertion into a target site are often used for genome engineering by insertional mutagenesis and transgenesis. The piggyBac element is especially useful because it can excise precisely from an insertion site, restoring the site to its pretransposon state. Precise excision is particularly useful when transient transgenesis is needed, for example, in the transient introduction of transcription factors for induced pluripotent stem cell production. We have used mutagenesis to generate an Excision + Integration − transposase that allows piggyBac excision without potentially harmful reintegration. These mutations likely lie in a target DNA-binding domain.

ABSTRACT Mutations in CEP290 cause up to 30% of cases of Leber congenital amaurosis (LCA), a severe childhood blindness resulting from abnormalities in the photoreceptor connecting cilia that lead to rapid retinal degeneration. Like many genetic diseases, CEP290-LCA has considerable variable expressivity, indicating the presence of other factors that influence phenotypic outcome. Here, we have undertaken a phenotype-driven approach in mice to identify genetic modifiers of CEP290-mediated retinal degeneration through backcrosses and intercrosses between BXD24- Cep290 rd16 mice and the genetically distinct inbred CAST strain to introduce genetic variation. Optical coherence tomography was used to quantitatively measure retinal thickness as a surrogate indication of photoreceptor degeneration in the resulting rd16 -mutant mice. It was readily apparent that CEP290-mediated retinal degeneration in the resulting mice is sensitive to genetic background, with some mice exhibiting relatively thick laminated retinas and others having thin retinas with advanced disease. Quantitative trait locus (QTL) analysis identified multiple genomic loci capable of influencing the retinal degeneration phenotype in Cep290 -mutant mice that together account for 71.7% of the phenotypic variation in retinal thickness observed in our population. Following the QTL analysis, two suppressor loci were studied in detail through a combination of physical and molecular approaches to narrow the critical region for each QTL and identify the probable causative genetic variations.

Current treatments for retinal degenerative diseases are limited and cell replacement therapies, in tandem with a supportive biomaterial scaffold, serve as a promising emerging option. However, the development and in vitro testing of these therapies require large quantities of human retinal progenitor cells (RPCs) to thoroughly assess the impact of material properties, culture conditions, and surgical parameters on cell survival and fate to refine and optimize this approach. Although induced pluripotent stem cells (iPSCs) are an ideal cell source for human RPC derivation, large-scale production is resource-intensive and requires specialized expertise. In this study, our objective was to address this barrier by creating conditional, Tet-On SV40-T immortalized RPCs derived from human iPSCs. In our approach, we employ the Tet-On system to conditionally immortalize RPCs by inducing a SV40 large T (SV40-T) antigen, a gene known to influence cell cycle regulation and differentiation. We transduced human iPSCs with the Tet-On SV40-T system and analyzed their proliferation and RPC differentiation capabilities in the presence and absence of doxycycline (a tetracycline class of antibiotics). Our results revealed that while SV40-T immortalization increased cell proliferation, it adversely impacted the expression of crucial RPC markers (PAX6, SOX2, CHX10), leading to a significant loss of RPC identity and multipotency. This de-differentiation was irreversible, even after removing doxycycline, indicating permanent alterations in differentiation potential. Overall, this study highlights the challenges associated with generating and maintaining an immortal human RPC cell line, particularly with respect to balancing proliferation and differentiation. Our findings prompt further research into optimizing conditional immortalization techniques, culture conditions, and proliferation timing to maintain the integrity and functional characteristics of RPCs. Such advancements are crucial for reducing labor and costs associated with in vitro testing of therapeutics as we work toward the development of improved stem cell-based interventions for retinal disease.