Abstract Excitotoxicity is a neuronal death process initiated by over-stimulation of ionotropic glutamate receptors. Although dysregulation of proteolytic signaling networks is critical for excitotoxicity, the identity of affected proteins and mechanisms by which they induce neuronal cell death remain unclear. To address this, we used quantitative N-terminomics to identify proteins modified by proteolysis in neurons undergoing excitotoxic cell death. We found that most proteolytically processed proteins in excitotoxic neurons are likely substrates of calpains, including key synaptic regulatory proteins such as CRMP2, doublecortin-like kinase I, Src tyrosine kinase and calmodulin-dependent protein kinase IIβ (CaMKIIβ). Critically, calpain-catalyzed proteolytic processing of these proteins generates stable truncated fragments with altered activities that potentially contribute to neuronal death by perturbation of synaptic organization and function. Blocking calpain-mediated proteolysis of one of these proteins, Src protected against neuronal loss in a rat model of neurotoxicity. Extrapolation of our N-terminomic results led to the discovery that CaMKIIα, an isoform of CaMKIIβ undergoes differential processing in mouse brains under physiological conditions and during ischemic stroke. In summary, our findings inform excitotoxic neuronal death mechanism and suggest potential therapeutic strategies for neuroprotection. In Brief Ameen, et al. used a proteomic method called N-terminomics to identify proteolytic events occurring in neurons during excitotoxicity. They found that most proteolytic processing is mediated by calpains, resulting in the generation of stable truncated fragments with the potential to induce synaptic dysfunction and loss, eventually leading to neuronal death. They further showed that some of these proteolytic processed proteins, such as the protein kinases Src and CaMKII, are potential targets for neuroprotection. Highlights Identification of over 300 neuronal proteins cleaved by calpains to form stable truncated fragments during excitotoxicity. The calpain cleavage sites of these proteins unveil for the first time the preferred cleavage sequences of calpains in neurons. These pathological proteolytic events potentially induce synaptic dysfunction and loss, which likely contribute to excitotoxic neuronal death. Some of the neuronal proteins proteolyzed by calpains are potential targets of neuroprotection. Graphical abstract: Pathological proteolytic events in neurons during excitotoxicity unveiled by N-terminomic analyses (A) N-terminomic and global proteomic analyses identified neo-N-terminal sites and neuronal proteins undergoing significant abundance changes during excitotoxicity. (B) Informatic analysis of the proteomic results predicted (i) the preferred sequences of proteolytic processing of neuronal proteins catalyzed by calpains during excitotoxicity and (ii) perturbation of synaptic organization and functions as the major consequence of calpain-mediated proteolytic events. (C) Validation of these predictions and further experimentations unveiled: (i) calpain-mediated cleavage of proteins associated with synaptic damage in excitotoxic neurons, (ii) a new mechanism of dysregulation of CaMKIIα and CaMKIIβ, which are key protein kinases governing synaptic dysfunctions and excitotoxic neuronal death and (iii) potential therapeutic targets such as the protein kinases Src and CaMKII for neuroprotection One Sentence Summary Proteolytic events in neurons during excitotoxicity inform neuronal death mechanism and potential therapeutic strategies for neuroprotection.

Summary Excitotoxicity, a neuronal death process in neurological disorders, is initiated by over-stimulation of neuronal ionotropic glutamate receptors. The over-stimulated receptors dysregulate proteases, protein kinases and phosphatases, which in turn modify target neuronal proteins to induce cell death. To decipher this cell death mechanism, we used quantitative proteomics, phosphoproteomics and N-terminomics to identify modified proteins in excitotoxic neurons. Data, available in ProteomeXchange (identifiers: PXD019527 and PXD019211), enabled us to identify over one thousand such proteins with calpains, cathepsins and over twenty protein kinases as their major modifiers. These protein modification events can potentially perturb signalling pathways governing cell survival, synaptogenesis, axonal guidance and mRNA processing. Importantly, blocking the modification of Src protein kinase, a signalling hub in excitotoxic neurons, protected against neuronal loss in vivo in a rat model of neurotoxicity. Besides offering new insights into excitotoxic neuronal death mechanism, our findings suggest potential neuroprotective therapeutic targets for treating neurological disorders. Graphical abstract Highlights Multi-dimensional proteomic analysis identified proteins modified by proteolysis and altered phosphorylation in neurons undergoing excitotoxic cell death. Calpains, cathepsins and over twenty protein kinases are major modifiers of these proteins. These protein modification events are predicted to impact cell survival, axonal guidance, synaptogenesis and mRNA processing. Blocking modification of an identified protein Src, which acts as a major signalling hub in neurons, was protective against excitotoxic injury in vivo . In Brief Using multidimensional proteomic approaches, Ameen, et al . mapped the changes of proteome, phosphoproteome and N-terminome of cultured primary neurons during excitotoxicity, a crucial neuronal death process in neurological disorders. These proteomic changes document new excitotoxicity-associated molecular events, and offer insights into how these events are organized to induce neuronal death. Potential therapeutic relevance of these molecular events is illustrated by the demonstration that in vivo blockade of one of these events could protect against excitotoxic neuronal loss.