ABSTRACT Antibiotic resistance of Mycobacterium tuberculosis is exclusively a consequence of chromosomal mutations. Translesion synthesis (TLS) is a widely conserved mechanism of DNA damage tolerance and mutagenesis, executed by translesion polymerases such as DinBs. In mycobacteria, DnaE2 is the only known agent of TLS and the role of DinB polymerases is unknown. Here we demonstrate that mycobacterial DinB1 abets insertion and deletion frameshift mutagenesis in homo-oligonucleotide runs. DinB1 is the primary mediator of spontaneous −1 frameshift mutations in homo-oligonucleotide runs whereas DnaE2 and DinBs are redundant in DNA damage-induced −1 frameshift mutagenesis. DinB1 also promotes missense mutations conferring resistance to rifampicin, with a mutational signature distinct from that of DnaE2. These results highlight DinB1 and DnaE2 as drivers of mycobacterial genome diversification with relevance to antimicrobial resistance and host adaptation.

Abstract DNA repair systems allow microbes to survive in diverse environments that compromise chromosomal integrity. Pathogens such as M. tuberculosis must contend with the genotoxic host environment, which generates the mutations that underlie antibiotic resistance. Mycobacteria encode the widely distributed SOS pathway, governed by the LexA repressor, but also encode PafBC, a positive regulator of the transcriptional DNA damage response (DDR). Although the transcriptional outputs of these systems have been characterized, their full functional division of labor in survival and mutagenesis is unknown. Here we specifically ablate the PafBC or SOS pathways, alone and in combination, and test their relative contributions to repair. We find that SOS and PafBC have both distinct and overlapping roles that depend on the type of DNA damage. Most notably, we find that quinolone antibiotics and replication fork perturbation are inducers of the PafBC pathway, and that chromosomal mutagenesis is codependent on PafBC and SOS, through shared regulation of the DnaE2/ImuA/B mutasome. These studies define the complex transcriptional regulatory network of the DDR in mycobacteria and provide new insight into the regulatory mechanisms controlling the genesis of antibiotic resistance in M. tuberculosis .

ABSTRACT RNase H enzymes participate in various processes that require processing of RNA:DNA hybrids, including DNA replication, transcription, and ribonucleotide excision from DNA. Mycobacteria encode multiple RNase H enzymes and prior data indicates that RNase HI activity is essential for mycobacterial viability. However, the additional roles of mycobacterial RNase Hs are unknown, including whether RNase HII (RnhB and RnhD) excises chromosomal ribonucleotides misincorporated during DNA replication and whether individual RNase HI enzymes (RnhA and RnhC) mediate additional phenotypes. We find that loss of RNase HII activity in M. smegmatis (through combined deletion of rnhB/rnhD ) or individual RNase HI enzymes, does not affect growth, hydroxyurea sensitivity, or mutagenesis, whereas overexpression of either RNase HII severely compromises bacterial viability. We also show that deletion of rnhC , which encodes a protein with an N terminal RNase HI domain and a C terminal acid phosphatase domain, confers sensitivity to rifampicin and oxidative stress as well as loss of light induced carotenoid pigmentation. These phenotypes are due to loss of the activity of the C terminal acid phosphatase domain rather than the RNase HI activity, suggesting that the acid phosphatase activity may confer rifampicin resistance through the antioxidant properties of carotenoid pigment production.

ABSTRACT Translesion synthesis mediated by translesion polymerases is a conserved mechanism of DNA damage tolerance. In bacteria, DinB enzymes are widely distributed promutagenic translesion polymerases. The role of DinBs in mycobacterial mutagenesis was unclear until recent studies revealed a role for mycobacterial DinB1 in substitution and frameshift mutagenesis, overlapping with that of translesion polymerase DnaE2. M. smegmatis encodes two additional DinBs (DinB2 and DinB3) and M. tuberculosis encodes DinB2, but the roles of these polymerases in mycobacterial damage tolerance and mutagenesis is unknown. The biochemical properties of DinB2, including facile utilization of ribonucleotides and 8-oxo-guanine, suggest that DinB2 could be a promutagenic polymerase. Here we examine the effects of DinB2 and DinB3 overexpression in mycobacterial cells. We demonstrate that DinB2 can drive diverse substitution mutations conferring antibiotic resistance. DinB2 induces frameshift mutations in homopolymeric sequences, both in vitro and in vivo. DinB2 switches from less to more mutagenic in the presence of manganese in vitro. This study indicates that DinB2 may contribute to mycobacterial mutagenesis and antibiotic resistance acquisition in combination with DinB1 and DnaE2.