Abstract Secretory preproteins of the Sec pathway bear signal peptides and are targeted post-translationally to cross the plasma membrane or ER through translocases. After translocation and signal peptide cleavage, mature domains fold to native states in the bacterial periplasm or after further trafficking. During cytoplasmic transit, mature domains must remain non-folded for translocase recognition and translocation. Here, we sought the structural basis for the delayed folding mechanism of mature domains and how this is regulated by signal peptides. To address this, we compared how evolution diversified a periplasmic peptidyl-prolyl isomerase PpiA mature domain from its structural twin cytoplasmic PpiB. Using global and local hydrogen deuterium exchange mass spectrometry we showed that PpiA is a slower folder. We defined at near-residue resolution hierarchical folding initiated by similar foldons in the twins, that displayed different order and rates. Folding is delayed in PpiA by less hydrophobic/bulky native contacts, frustrated residues and a critical β -turn in the early folding region and by signal peptide-driven disorder, which disrupts foldon hierarchy. When selected PpiA residues and its signal peptide were grafted onto PpiB they converted it into a slow folder with enhanced in vivo secretion. These data reveal the structural basis of non-folding in a secretory protein, that allows its trafficking.

Abstract Novel biophysical tools allow the structural dynamics of proteins, and the regulation of such dynamics by binding partners, to be explored in unprecedented detail. Although this has provided critical insights into protein function, the means by which structural dynamics direct protein evolution remains poorly understood. Here, we investigated how proteins with a bilobed structure, composed of two related domains from the type-II periplasmic binding protein domain family, have undergone divergent evolution leading to modification of their structural dynamics and function. We performed a structural analysis of ~600 bilobed proteins with a common primordial structural core, which we complemented with biophysical studies to explore the structural dynamics of selected examples by single-molecule Förster resonance energy transfer and Hydrogen-Deuterium exchange mass spectrometry. We show that evolutionary modifications of the structural core, largely at its termini, enables distinct structural dynamics, allowing the diversification of these proteins into transcription factors, enzymes, and extra-cytoplasmic transport-related proteins. Structural embellishments of the core created new interdomain interactions that stabilized structural states, reshaping the active site geometry, and ultimately, altered substrate specificity. Our findings reveal an as yet unrecognized mechanism for the emergence of functional promiscuity during long periods of protein evolution and are applicable to a large number of domain architectures.