ABSTRACT Activating estrogen receptor alpha (ER) mutations are present in primary endometrial and metastatic breast cancers, promoting estrogen-independent activation of the receptor. Functional characterizations in breast cancer have established unique molecular and phenotypic consequences of the receptor, yet the impact of ER mutations in endometrial cancer has not been fully explored. In this study, we used CRISPR-Cas9 to model the clinically prevalent ER-Y537S mutation and compared results to ER-D538G to discover allele-specific differences between ER mutations in endometrial cancer. We found that constitutive activity of mutant ER resulted in changes in the expression of thousands of genes, stemming from combined alterations to ER binding and chromatin accessibility. The unique gene expression programs resulted in ER mutant cells developing increased cancer associated phenotypes, including migration, invasion, anchorage independent growth, and growth in vivo . To uncover potential treatment strategies, we identified ER associated proteins via Rapid Immunoprecipitation and Mass Spectrometry of Endogenous Proteins (RIME) and interrogated two candidates, CDK9 and NCOA3. Inhibition of these regulatory proteins resulted in decreased growth and migration, representing potential novel treatment strategies for ER mutant endometrial cancer. Implications This study provides insight into mutant ER activity in endometrial cancer and identifies potential therapies for women with ER mutant endometrial cancer. STATEMENT OF SIGNIFICANCE Activating estrogen receptor alpha (ER) mutations promote ligand-independent activity of the receptor. This study evaluates ER-Y537S and ER-D538G mutations in primary endometrial cancer, revealing their effects on gene regulation and cancer-associated phenotypes. By identifying ER associated proteins, we also uncover potential novel treatments for women with ER mutant endometrial cancer.

Transcriptional enhancers can regulate individual or multiple genes through long-range three-dimensional (3D) genome interactions, and these interactions are commonly altered in cancer. Yet, the functional relationship between changes in 3D interactions associated with regulatory regions and differential gene expression appears context-dependent. In this study, we used HiChiP to capture changes in 3D genome interactions between active regulatory regions of endometrial cancer cells in response to estrogen treatment and uncovered significant differential long-range interactions that are strongly enriched for estrogen receptor α (ER) bound sites (ERBS). The ERBS anchoring differential loops with either a gene's promoter or distal regions were correlated with larger transcriptional responses to estrogen compared to ERBS not involved in differential interactions. To functionally test this observation, CRISPR-based Enhancer-i was used to deactivate specific ERBS, which revealed a wide range of effects on the transcriptional response to estrogen. However, these effects are only subtly and not significantly stronger for ERBS in differential loops. In addition, we observed an enrichment of 3D interactions between the promoters of estrogen up-regulated genes and found that looped promoters can work together cooperatively. Overall, our work suggests that changes in 3D genome structure upon estrogen treatment identify some functionally important regulatory regions; however, these changes aren't required for a transcriptional response to E2 in endometrial cancer cells.

Abstract Most endometrial cancers express the hormone receptor estrogen receptor alpha (ER) and are driven by excess estrogen signaling. However, evaluation of the estrogen response in endometrial cancer cells has been limited by the availability of hormonally responsive in vitro models, with one cell line, Ishikawa, being used in most studies. Here, we describe a novel, adherent endometrioid endometrial cancer (EEC) cell line model, HCI-EC-23. We show that HCI-EC-23 retains ER expression and that ER functionally responds to estrogen induction over a range of passages. We also demonstrate that this cell line retains paradoxical activation of ER by tamoxifen, which is also observed in Ishikawa and is consistent with clinical data. The mutational landscape shows that HCI-EC-23 is mutated at many of the commonly altered genes in EEC, has relatively few copy-number alterations, and is microsatellite instable high (MSI-high). In vitro proliferation of HCI-EC-23 is strongly reduced upon combination estrogen and progesterone treatment. HCI-EC-23 exhibits strong estrogen dependence for tumor growth in vivo and tumor size is reduced by combination estrogen and progesterone treatment. Molecular characterization of estrogen induction in HCI-EC-23 revealed hundreds of estrogen-responsive genes that significantly overlapped with those regulated in Ishikawa. Analysis of ER genome binding identified similar patterns in HCI-EC-23 and Ishikawa, although ER exhibited more bound sites in Ishikawa. This study demonstrates that HCI-EC-23 is an estrogen- and progesterone-responsive cell line model that can be used to study the hormonal aspects of endometrial cancer.