Telomere erosion and subsequent dysfunction limits the proliferation of normal human cells by a process termed replicative senescence. Replicative senescence is thought to suppress tumorigenesis by establishing an essentially irreversible growth arrest that requires activities of the p53 and pRB tumor suppressor proteins. We show that, depending on expression of the pRB regulator p16, replicative senescence is not necessarily irreversible. We used lentiviruses to express specific viral and cellular proteins in senescent human fibroblasts and mammary epithelial cells. Expression of telomerase did not reverse the senescence arrest. However, cells with low levels of p16 at senescence resumed robust growth upon p53 inactivation, and limited growth upon expression of oncogenic RAS. In contrast, cells with high levels of p16 at senescence failed to proliferate upon p53 inactivation or RAS expression, although they re-entered the cell cycle without growth after pRB inactivation. Our results indicate that the senescence response to telomere dysfunction is reversible and is maintained primarily by p53. However, p16 provides a dominant second barrier to the unlimited growth of human cells.

Retrotransposable elements are deleterious at many levels, and the failure of host surveillance systems for these elements can thus have negative consequences. However, the contribution of retrotransposon activity to ageing and age-associated diseases is not known. Here we show that during cellular senescence, L1 (also known as LINE-1) retrotransposable elements become transcriptionally derepressed and activate a type-I interferon (IFN-I) response. The IFN-I response is a phenotype of late senescence and contributes to the maintenance of the senescence-associated secretory phenotype. The IFN-I response is triggered by cytoplasmic L1 cDNA, and is antagonized by inhibitors of the L1 reverse transcriptase. Treatment of aged mice with the nucleoside reverse transcriptase inhibitor lamivudine downregulated IFN-I activation and age-associated inflammation (inflammaging) in several tissues. We propose that the activation of retrotransposons is an important component of sterile inflammation that is a hallmark of ageing, and that L1 reverse transcriptase is a relevant target for the treatment of age-associated disorders. During cellular senescence in human and mouse cells, L1 transposons become transcriptionally derepressed and trigger a type-1 interferon response, which contributes to age-associated inflammation and age-related phenotypes.

The DNA-damage response (DDR) arrests cell-cycle progression until damage is removed. DNA-damage-induced cellular senescence is associated with persistent DDR. The molecular bases that distinguish transient from persistent DDR are unknown. Here we show that a large fraction of exogenously induced persistent DDR markers is associated with telomeric DNA in cultured cells and mammalian tissues. In yeast, a chromosomal DNA double-strand break next to a telomeric sequence resists repair and impairs DNA ligase 4 recruitment. In mammalian cells, ectopic localization of telomeric factor TRF2 next to a double-strand break induces persistent DNA damage and DDR. Linear, but not circular, telomeric DNA or scrambled DNA induces a prolonged checkpoint in normal cells. In terminally differentiated tissues of old primates, DDR markers accumulate at telomeres that are not critically short. We propose that linear genomes are not uniformly reparable and that telomeric DNA tracts, if damaged, are irreparable and trigger persistent DDR and cellular senescence.

Cellular senescence prevents the proliferation of cells at risk for neoplastic transformation. Nonetheless, the senescence response is thought to be antagonistically pleiotropic and thus contribute to aging phenotypes, including, ironically, late life cancers. The cancer-promoting activity of senescent cells is likely due to secreted molecules, the identity of which remains largely unknown. Here, we have shown that senescent fibroblasts, much more than presenescent fibroblasts, stimulate tumor vascularization in mice. Weakly malignant epithelial cells co-injected with senescent fibroblasts had larger and greater numbers of blood vessels compared with controls. Accordingly, increased vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was a frequent characteristic of senescent human and mouse fibroblasts in culture. Importantly, conditioned medium from senescent fibroblasts, more than medium from presenescent cells, stimulates cultured human umbilical vein endothelial cells to invade a basement membrane, a hallmark of angiogenesis. Increased VEGF expression was specific to the senescent phenotype and increased whether senescence was induced by replicative exhaustion, overexpression of p16Ink4a, or overexpression of oncogenic RAS. The senescence-dependent increase in VEGF production was accompanied by very little increase in hypoxic-inducible (transcription) factor 1 α protein levels, and hypoxia further induced VEGF in senescent cells. This result suggests the rise in VEGF expression at senescence is not a hypoxic response. Our findings may in part explain why senescent cells stimulate tumorigenesis in vivo and support the idea that senescent cells may facilitate age-associated cancer development by secreting factors that promote malignant progression. Cellular senescence prevents the proliferation of cells at risk for neoplastic transformation. Nonetheless, the senescence response is thought to be antagonistically pleiotropic and thus contribute to aging phenotypes, including, ironically, late life cancers. The cancer-promoting activity of senescent cells is likely due to secreted molecules, the identity of which remains largely unknown. Here, we have shown that senescent fibroblasts, much more than presenescent fibroblasts, stimulate tumor vascularization in mice. Weakly malignant epithelial cells co-injected with senescent fibroblasts had larger and greater numbers of blood vessels compared with controls. Accordingly, increased vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was a frequent characteristic of senescent human and mouse fibroblasts in culture. Importantly, conditioned medium from senescent fibroblasts, more than medium from presenescent cells, stimulates cultured human umbilical vein endothelial cells to invade a basement membrane, a hallmark of angiogenesis. Increased VEGF expression was specific to the senescent phenotype and increased whether senescence was induced by replicative exhaustion, overexpression of p16Ink4a, or overexpression of oncogenic RAS. The senescence-dependent increase in VEGF production was accompanied by very little increase in hypoxic-inducible (transcription) factor 1 α protein levels, and hypoxia further induced VEGF in senescent cells. This result suggests the rise in VEGF expression at senescence is not a hypoxic response. Our findings may in part explain why senescent cells stimulate tumorigenesis in vivo and support the idea that senescent cells may facilitate age-associated cancer development by secreting factors that promote malignant progression. In complex organisms such as mammals, diverse stress can induce proliferative cells to either die by programmed cell death (apoptosis) or irreversibly withdraw from the cell cycle by a process termed cellular senescence. Both responses most likely evolved to suppress the proliferation of dysfunctional or damaged cells and hence the possibility of oncogenic transformation (1Campisi J. Trends Cell Biol. 2001; 11: 27-31Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (424) Google Scholar). Whether a cell undergoes apoptosis or senescence can have important, yet different, physiological consequences, especially over the life span. Apoptosis effectively eliminates defective cells but can eventually lead to tissue atrophy. By contrast, senescent cells generally resist apoptosis and thus can accumulate in vivo (2Dimri G.P. Lee X. Basile G. Acosta M. Scott G. Roskelley C. Medrano E.E. Linskens M. Rubelj I. Pereira-Smith O.M. Peacocke M. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 9363-9367Crossref PubMed Scopus (5558) Google Scholar, 3Vasile E. Tomita Y. Brown L.F. Kocher O. Dvorak H.F. FASEB J. 2001; 15: 458-466Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar, 4Choi J. Shendrik I. Peacocke M. Peehl D. Buttyan R. Ikeguchi E.F. Katz A.E. Benson M.C. Urology. 2000; 56: 160-166Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (129) Google Scholar, 5Sasaki M. Ikeda H. Haga H. Manabe T. Nakanuma Y. J. Pathol. 2005; 205: 451-459Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar); however, because they secrete biologically active molecules, these irreversibly growth-arrested cells can alter the behavior of neighboring cells (reviewed in Refs. 6Campisi J. Cell. 2005; 120: 513-522Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1765) Google Scholar, 7Roninson I.B. Cancer Lett. 2002; 179: 1-14Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). Thus, both the apoptotic and senescence responses may be antagonistically pleiotropic, benefiting young organisms by protecting them from cancer early in life but causing detrimental effects later in life (1Campisi J. Trends Cell Biol. 2001; 11: 27-31Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (424) Google Scholar). A diversity of stresses can induce cellular senescence (reviewed in Ref. 8Serrano M. Blasco M.A. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: 748-753Crossref PubMed Scopus (343) Google Scholar). These include the dysfunctional telomeres that result from repeated cell division (replicative senescence), severe or irreparable DNA damage (genotoxic stress), the expression of certain oncogenes (oncogene-induced senescence), and agents or conditions that disrupt chromatin organization. Despite the disparate mechanisms by which these stresses act, senescent cells share numerous features, including an arrest of cell proliferation that cannot be reversed by physiological signals, an enlarged flattened morphology, expression of a neutral β-galactosidase (senescence-associated β-galactosidase), and an altered pattern of gene expression. The senescence response depends on the activities of two major tumor suppressor pathways, one controlled by p53 and another controlled by p16INK4a and pRB (reviewed in Ref. 6Campisi J. Cell. 2005; 120: 513-522Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1765) Google Scholar). We have shown that senescent stromal fibroblasts secrete factors that can alter the structure and function of normal epithelial tissue structures (9Parrinello S. Coppe J.P. Krtolica A. Campisi J. J. Cell Sci. 2005; 118: 485-496Crossref PubMed Scopus (437) Google Scholar). In addition, we found that senescent fibroblasts secrete factors that can stimulate the proliferation of premalignant epithelial cells in culture and facilitate their conversion to malignant tumors in vivo (10Krtolica A. Parrinello S. Lockett S. Desprez P.Y. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 12072-12077Crossref PubMed Scopus (1131) Google Scholar). This finding suggests that the senescence of stromal cells might cooperate with the acquisition of oncogenic mutations by epithelial cells to promote late life cancers (11DePinho R.A. Nature. 2000; 408: 248-254Crossref PubMed Scopus (739) Google Scholar). Indirect support for this idea derives from studies of irradiated stromal cells. Sublethal irradiation of normal breast stroma increased the incidence of breast tumors in mice (12Barcellos-Hoff M.H. Ravani S.A. Cancer Res. 2000; 60: 1254-1260PubMed Google Scholar). Likewise, irradiated fibroblasts produced factors that increased the invasiveness of pancreatic cancer cells in culture (13Ohuchida K. Mizumoto K. Murakami M. Qian L.W. Sato N. Nagai E. Matsumoto K. Nakamura T. Tanaka M. Cancer Res. 2004; 64: 3215-3222Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar). 2J. P. Coppé and J. Campisi, manuscript in preparation. 2J. P. Coppé and J. Campisi, manuscript in preparation. Because genotoxic stress, including irradiation, induces a senescence response, especially in fibroblasts (14Ben-Porath I. Weinberg R.A. J. Clin. Investig. 2004; 113: 8-13Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar), it is likely in these studies that fibroblasts became senescent after irradiation. The identity of the cancer-promoting factors produced by senescent fibroblasts remains largely unknown. In some respects, the phenotype of senescent fibroblasts resembles that of tumor- or carcinoma-associated fibroblasts (15Olumi A.F. Grossfeld G.D. Hayward S.W. Carroll P.R. Tlsty T.D. Cunha G.R. Cancer Res. 1999; 59: 5002-5011PubMed Google Scholar), which are thought to provide factors that facilitate the ability of the developing carcinoma to invade and survive in the surrounding tissue. Recently, a mechanism by which tumor-associated fibroblasts promote cancer development was elucidated (16Orimo A. Gupta P.B. Sgroi D.C. Arenzana-Seisdedos F. Delaunay T. Naeem R. Carey V.J. Richardson A.L. Weinberg R.A. Cell. 2005; 121: 335-348Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2801) Google Scholar). This study showed that such fibroblasts might promote human breast cancer progression by secreting stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) 3The abbreviations used are: SDF-1, stromal cell-derived factor 1; VEGF, vascular endothelial growth factor; HUVEC, human umbilical vascular endothelial cell; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; mBF, mouse breast fibroblast; vWF, von Willebrand factor; GFP, green fluorescent protein; HIF-1α, hypoxic-inducible (transcription) factor 1 α. 3The abbreviations used are: SDF-1, stromal cell-derived factor 1; VEGF, vascular endothelial growth factor; HUVEC, human umbilical vascular endothelial cell; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; mBF, mouse breast fibroblast; vWF, von Willebrand factor; GFP, green fluorescent protein; HIF-1α, hypoxic-inducible (transcription) factor 1 α.. SDF-1 recruits endothelial progenitor cells and hence stimulates new blood vessel formation, or angiogenesis. Angiogenesis is considered one of six important steps required for the development of a malignant tumor (17Hanahan D. Weinberg R.A. Cell. 2000; 100: 57-70Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (21638) Google Scholar). Here, we have shown that senescent human lung fibroblasts may likewise promote tumorigenesis by stimulating angiogenesis but in this case by secreting elevated levels of angiogenic factors, one of which is the vascular endothelial growth factor (VEGF). We showed that fibroblast-secreted VEGF stimulates the invasiveness of human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) in culture and that the presence of senescent fibroblasts increased the vascularization of tumors in mice. The elevated VEGF production by senescent fibroblasts was due in part to increased VEGF mRNA levels and occurred whether cells were induced to senesce by replicative exhaustion, expression of oncogenic RAS, or overexpression of p16INK4a. Further, senescent fibroblasts had only slightly elevated levels of HIF-1α, a transcription factor that induces VEGF expression in response to hypoxia (18Mukhopadhyay D. Datta K. Semin. Cancer Biol. 2004; 14: 123-130Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar), and retained the ability to further induce VEGF in response to hypoxia. Our findings suggest that up-regulated VEGF expression comprises part of the senescent phenotype of some human fibroblasts, independent of the hypoxic response. Cells and Cell Culture—HUVECs (Clonetics) were cultivated in EGM-2 medium (Clonetics). Human WI-38 and IMR90 (fetal lung) and HCA2 and BJ (foreskin) fibroblasts were obtained, cultured, and passaged to senescence in atmospheric oxygen as described (19Dimri G.P. Itahana K. Acosta M. Campisi J. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 273-285Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 20Itahana K. Dimri G.P. Hara E. Itahana Y. Zou Y. Desprez P.Y. Campisi J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 18206-18214Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (83) Google Scholar). Human and mouse breast fibroblasts and EpH4-v mouse epithelial tumor cells were obtained from Dr. M. Stampfer as primary fibroblasts from patients who underwent breast reduction, and as described (9Parrinello S. Coppe J.P. Krtolica A. Campisi J. J. Cell Sci. 2005; 118: 485-496Crossref PubMed Scopus (437) Google Scholar, 21Parrinello S. Samper E. Krtolica A. Goldstein J. Melov S. Campisi J. Nat. Cell Biol. 2003; 5: 741-747Crossref PubMed Scopus (863) Google Scholar). Cells were judged to be senescent as described (2Dimri G.P. Lee X. Basile G. Acosta M. Scott G. Roskelley C. Medrano E.E. Linskens M. Rubelj I. Pereira-Smith O.M. Peacocke M. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 9363-9367Crossref PubMed Scopus (5558) Google Scholar, 19Dimri G.P. Itahana K. Acosta M. Campisi J. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 273-285Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 20Itahana K. Dimri G.P. Hara E. Itahana Y. Zou Y. Desprez P.Y. Campisi J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 18206-18214Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (83) Google Scholar). WI-38 cells were made quiescent by incubating for 72 h in growth medium supplemented with 0.2% fetal bovine serum as described (20Itahana K. Dimri G.P. Hara E. Itahana Y. Zou Y. Desprez P.Y. Campisi J. J. Biol. Chem. 2002; 277: 18206-18214Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (83) Google Scholar). For hypoxic conditions, cells were grown in a humidified chamber adjusted to 1% oxygen. Vectors and Viral Infections—Infectious virus was produced by transiently transfecting lenti and packaging vectors into 293T cells as described (22Naldini L. Blomer U. Gallay P. Ory D. Mulligan R. Gage F.H. Verma I.M. Trono D. Science. 1996; 272: 263-267Crossref PubMed Scopus (3937) Google Scholar). All lentiviral constructs (lenti-GFP, lenti-p16, lenti-Ha-RASv12) have been described (23Beausejour C.M. Krtolica A. Galimi F. Narita M. Lowe S.W. Yaswen P. Campisi J. EMBO J. 2003; 22: 4212-4222Crossref PubMed Scopus (953) Google Scholar). Non-integrating lentiviruses were generated using the same method, except that a mutated integrase (D64V) plasmid (a gift from Dr. Robert Marr, Salk Institute, La Jolla, CA) was used (24Leavitt A.D. Robles G. Alesandro N. Varmus H.E. J. Virol. 1996; 70: 721-728Crossref PubMed Google Scholar). Viral supernatants were concentrated by ultracentrifugation and titers determined by ELISA for p24, using a commercial kit (Zeptometrics). Cells were infected in the presence of 6 μg/ml polybrene at a multiplicity of infection of 50 unless otherwise indicated. Test infections using lenti-GFP showed that a multiplicity of infection of 25 gave infection efficiencies of >99%. Western Blotting and ELISA Assay—We performed Western analysis as described (19Dimri G.P. Itahana K. Acosta M. Campisi J. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 273-285Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar) using the following primary antibodies, actin (Chemicon MAB1501), HIF-1α (BD Biosciences 610959). Secreted VEGF and SDF-1α protein concentrations were measured using commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Quantikine; R&D Systems). Volumes of cell culture supernatants were normalized to the total number of cells present at the time of collection. Invasion Assay—Conditioned medium was collected by washing cells twice with phosphate-buffered saline, followed by a 48-h incubation in serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium. An equal number of cells were plated at the start of the experiment, and cell numbers were determined after the 48-h incubation; when necessary, conditioned medium volumes were normalized to the total number of cells present at the end of the 48-h period. 24-well format 8-μm cell culture inserts (BD Biosciences 354578) were coated with 12.5 μl of Matrigel (BD Biosciences 356234) diluted 1:1 with serum-free cell culture medium. The coated cell culture inserts were placed atop 300 μl of conditioned medium or serum-free medium + recombinant human VEGF. 1 × 105 HUVEC cells in 200 μl of serum-free medium were added on top of the Matrigel layer. HUVECs were preincubated in serum-free medium for 12 h prior to plating on Matrigel. HUVECs were allowed to invade the Matrigel for 36 h, after which they were fixed, stained, and counted. When indicated, conditioned medium was incubated for 1 h at 4 °C in the presence of 0.5 μg/ml anti-human VEGF antibody (R&D Systems AF-293-NA). Human recombinant VEGF (15 ng/ml) was used as a positive control. Tumor Studies and vWF Immunostaining—Tumorigenic studies were performed as previously described (10Krtolica A. Parrinello S. Lockett S. Desprez P.Y. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 12072-12077Crossref PubMed Scopus (1131) Google Scholar). In brief, 0.75 million EpH4-v epithelial cells were injected in the presence (or absence) of one million primary mouse breast fibroblasts (MBF). 200 μl of serum-free medium containing resuspended cells was injected subcutaneously underneath the sixth nipple. After 60 days, tumors were excised, embedded in paraffin, and stained for the von Willebrand factor (vWF) endothelial cell marker (RB-281-A; Neo Marker) In brief, tissue sections were deparaffinized, treated with proteinase K, blocked with bovine serum albumin, and incubated with the vWF primary antibody and subsequently with a biotinylated goat anti-rabbit secondary antibody. A peroxidase kit (SK-4100) from Vector Laboratories was used for detection. Tissue sections were counterstained with hematoxylin. RNA Isolation and Real-time PCR—For RNA isolation, cells were lysed directly on the culture plate using lysis buffer provided in the RNeasy kit with DNase I digestion (Qiagen, Valencia, CA). The relative abundance of target gene mRNA, as well as the internal control 18 S rRNA, was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) performed on an ABI PRISM 7700 sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primers and probe for VEGF (all isoforms) were: upper primer, 5′-TAC-CTC-CAC-CAT-GCC-AAG-TG-3′, lower primer, 5′-GAT-GAT-TCT-GCC-CTC-CTC-CTT-3′, and probe, 5′-6FAM-TCC-CAG-GCT-GCA-CCC-ATG-GC-TAMRA-3′. Primers and probe for SDF-1α were: upper primer, 5′-TCT-CAA-AAT-TCT-CAA-CAC-TCC-AAA-CT-3′, lower primer, 5′-GCA-CAC-TTG-TCT-GTT-GTT-GTT-CTT-3′ and probe, 5′-6FAM-TGC-CCT-TCA-GAT-TGT-AGC-CCG-GC-TA-MRA-3′. Primers and probe for ribosomal 18 S and histone 1a (H1a) genes were from the Applied Biosystems kit (4308329) and from the University of California at San Francisco core facility, respectively. Expression levels were calculated against a standard curve using serial dilutions of total RNA. Analyses were performed in quadruplicate for each sample. Values presented are the ratio of target mRNA to 18 S RNA. Statistical analyses were performed using a non-paired Student t test or one-way analysis of variance and considered significant when p was <0.05. Conditioned Medium from Senescent Fibroblasts Stimulates HUVEC Invasiveness—We reported that senescent WI-38 fibroblasts promote the tumorigenic progression of preneoplastic epithelial cells when co-injected into immunocompromised mice (10Krtolica A. Parrinello S. Lockett S. Desprez P.Y. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 12072-12077Crossref PubMed Scopus (1131) Google Scholar). The resulting tumors were large and vascularized, suggesting that angiogenesis had occurred during tumor progression. Angiogenesis is essential for the survival of tumors located >100–200 μm from blood vessels and generally occurs because tumor and/or surrounding stromal cells secrete factors that stimulate the proliferation, migration, and invasion of surrounding endothelial cells (25Tonini T. Rossi F. Claudio P.P. Oncogene. 2003; 22: 6549-6556Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). We therefore asked whether senescent WI-38 fibroblasts secrete factors that stimulate endothelial cell migration and invasion. We collected conditioned media from presenescent and replicatively senescent fibroblasts and used them as attractants in a cell culture assay for the migration and invasion of HUVECs through basement membrane components, commercially supplied as Matrigel. Conditioned medium from senescent fibroblasts was 3-fold more potent than medium from presenescent fibroblasts in stimulating HUVEC migration and invasion (Fig. 1). One of the most potent angiogenic factors identified to date is VEGF (26Leung D.W. Cachianes G. Kuang W.J. Goeddel D.V. Ferrara N. Science. 1989; 246: 1306-1309Crossref PubMed Scopus (4396) Google Scholar). To determine whether VEGF was responsible for the senescence-associated stimulation of HUVEC migration and invasion, we pretreated the conditioned medium with a VEGF-blocking antibody. Pretreatment of presenescent conditioned medium reduced HUVEC invasiveness to the level seen when no attractant was provided (background invasiveness) (Fig. 1A). Thus, essentially all the invasion stimulated by presenescent conditioned medium was due to VEGF. Likewise, VEGF-blocking antibody substantially reduced the ability of senescent conditioned medium to stimulate HUVEC invasiveness, reducing it to about the level stimulated by presenescent conditioned medium (Fig. 1A). Nonetheless, the antibody failed to inhibit a significant fraction (∼45%) of the invasion stimulated by senescent conditioned medium (Fig. 1A). Still, the VEGFdependent blocked fraction (72 cells/field) triggered by senescent conditioned medium was significantly higher (p < 0.02) compared with the VEGF-dependent fraction stimulated by presenescent conditioned medium (45 cells/field). The blocking antibody was very effective (>90%) at blocking the ability of recombinant VEGF to stimulate HUVEC invasiveness (Fig. 1B). For this experiment, recombinant VEGF was use at 15 ng/ml, a concentration exceeding that present in senescent conditioned medium by >7-fold (see Fig. 2). These findings suggest that senescent fibroblasts secrete more VEGF than presenescent fibroblasts but also secrete factors in addition to VEGF that promote HUVEC invasion. VEGF is Up-regulated in Senescent Fibroblasts—To directly determine whether senescent fibroblasts up-regulate VEGF expression, we used real-time quantitative PCR and an ELISA assay to measure VEGF mRNA and secreted protein, respectively. Compared with presenescent fibroblasts, senescent WI-38 fibroblasts expressed 2- to 3-fold more VEGF mRNA (Fig. 2A). Notably, this 2-fold increase in mRNA resulted in a 6-fold increase in secreted VEGF protein (Fig. 2B). Interestingly, senescent WI-38 fibroblasts expressed no more SDF-1 mRNA or protein than their presenescent counterparts (Fig. 2, C and D). Thus, although senescent fibroblasts have biological properties that overlap with those of tumor-associated fibroblasts (15Olumi A.F. Grossfeld G.D. Hayward S.W. Carroll P.R. Tlsty T.D. Cunha G.R. Cancer Res. 1999; 59: 5002-5011PubMed Google Scholar, 16Orimo A. Gupta P.B. Sgroi D.C. Arenzana-Seisdedos F. Delaunay T. Naeem R. Carey V.J. Richardson A.L. Weinberg R.A. Cell. 2005; 121: 335-348Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2801) Google Scholar), in at least some cases senescent and tumor-associated fibroblasts may achieve similar biological effects by different molecular mechanisms. Analysis of other fibroblast cell strains confirmed that increased VEGF expression was not restricted to WI-38. Indeed, we found 4- to 5-fold more VEGF expression in senescent compared with presenescent human fetal lung IMR90 and human adult breast fibroblasts (Fig. 3, hBF). Surprisingly, no increase in VEGF expression was observed in human neonatal foreskin HCA2 and BJ fibroblasts (Fig. 3). The reason why VEGF up-regulation is not a hallmark of all senescent fibroblast cell lines remains to be determined; cell strain-specific differences in p16 regulation may play a role (see “Discussion”). Senescent Fibroblasts Increase Vascularization of Tumor in Mice—To determine the physiological relevance of the senescent-associated increase in VEGF expression we injected weakly tumorigenic EpH4-v mouse epithelial cells alone or together with presenescent or senescent mouse breast fibroblasts (mBF). Two months later, the EpH4-v tumors were excised and immunostained for the vWF endothelial-specific marker. The results revealed very significant augmentation in vascularization when senescent mBF were co-injected with EpH4-v (Fig. 4, A–C). Both the number and size of vWF-positive vessels were increased by the co-injection of senescent mBF (Fig. 4D). Interestingly, the most striking difference was the presence of numerous large vessels (>0.1 mm) in the mBF senescent group. Large vessels were virtually absent from control tumors resulting from EpH4-v cells injected alone or together with presenescent mBF. Of particular interest, increased vascularization was observed despite mBF having only a 2-fold change in VEGF secretion at senescence (Fig. 4E). As expected, tumors excised from animals injected with Eph4-v cells alone or together with presenescent fibroblasts were on average significantly smaller (74 and 105 mm3, respectively) compared with tumors injected with senescent fibroblasts (174 mm3). Taken together, these results suggest that one mechanism by which senescent stromal cells facilitate tumor progression is by enhancing blood vessel formation. Increased VEGF Expression Is Senescence Specific—Is the enhanced VEGF expression due to the senescent phenotype per se or, alternatively, to the growth-arrested state of senescent fibroblasts? To answer this question, we cultured presenescent fibroblasts in serum-deficient medium for 3 days, which caused them to arrest growth in a reversible quiescent state (data not shown). In contrast to senescence, quiescence failed to increase VEGF mRNA or protein levels (Fig. 5A). These results suggest that enhanced VEGF production is not a consequence of the growth state of senescent cells but rather is a feature of the senescent phenotype. To more critically test the idea that enhanced VEGF expression is a consequence of senescence, we induced presenescent WI-38 cells to undergo rapid senescence by ectopically expressing p16INK4a or oncogenic RAS (Ha-RASv12), two known inducers of a rapid senescence response (23Beausejour C.M. Krtolica A. Galimi F. Narita M. Lowe S.W. Yaswen P. Campisi J. EMBO J. 2003; 22: 4212-4222Crossref PubMed Scopus (953) Google Scholar, 27Hara E. Uzman J.A. Dimri G.P. Nehlin J.O. Testori A. Campisi J. Dev. Genet. 1996; 18: 161-172Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar, 28Serrano M. Lin A.W. McCurrach M.E. Beach D. Lowe S.W. Cell. 1997; 88: 593-602Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3861) Google Scholar). We expressed p16INK4a, oncogenic RAS, or a control protein (green fluorescent protein, GFP) using lentiviral vectors, which allowed rapid ectopic expression in >99% of the population (see “Materials and Methods”). p16INK4a expression reduced cell proliferation within 4 days, whereas oncogenic RAS slightly stimulated proliferation before arresting growth, as expected (23Beausejour C.M. Krtolica A. Galimi F. Narita M. Lowe S.W. Yaswen P. Campisi J. EMBO J. 2003; 22: 4212-4222Crossref PubMed Scopus (953) Google Scholar, 27Hara E. Uzman J.A. Dimri G.P. Nehlin J.O. Testori A. Campisi J. Dev. Genet. 1996; 18: 161-172Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar, 28Serrano M. Lin A.W. McCurrach M.E. Beach D. Lowe S.W. Cell. 1997; 88: 593-602Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3861) Google Scholar). In either case, within 7 days after lentiviral transduction, cells ceased proliferation (Fig. 5B) and developed a senescent phenotype as determined by their large flat morphology and expression of the senescence-associated β-galactosidase (not shown) as described (2Dimri G.P. Lee X. Basile G. Acosta M. Scott G. Roskelley C. Medrano E.E. Linskens M. Rubelj I. Pereira-Smith O.M. Peacocke M. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 9363-9367Crossref PubMed Scopus (5558) Google Scholar). By contrast, cells infected with the control GFP-expressing lentivirus continued to proliferate (Fig. 5B). Quantitative real-time PCR and ELISA assays showed that VEGF mRNA and secreted protein levels increased in response to p16INK4a and oncogenic RAS, but not GFP (Fig. 5, C and D), to approximately the same levels induced by replicative senescence. Thus, WI-38 fibroblasts responded to replicative exhaustion, p16INK4a expression, and expression of oncogenic RAS, all of which induce senescence, by up-regulating VEGF expression. Senescent Fibroblasts Retain VEGF Inducibility by Hypoxia—The best-studied inducer of VEGF expression is hypoxia, which increases VEGF transcription by stabilizing and activating the hypoxic-inducible (transcription) factor 1 α (HIF-1α) (18Mukhopadhyay D. Datta K. Semin. Cancer Biol. 2004; 14: 123-130Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 29Shweiki D. Itin A. Soffer D. Keshet E. Nature. 1992; 359: 843-845Crossref PubMed Scopus (4100) Google Scholar). To determine whether the senescence-induced increase in VEGF production is caused by the same mechanism used by hypoxia, we determined the levels of HIF-1α in presenescent and senescent WI-38 fibroblasts. Senescent cells expressed only slightly more (<2-fold) HIF-1α than presenescent cells, a level far less than that induced by hypoxia (Fig. 6A). This was true whether cells were made senescent by replicative exhaustion or overexpression of p16INK4a (Fig. 6A). Interestingly, although hypoxia caused a striking accumulation of HIF-1α in presenescent cells, as expected, hypoxia failed to increase HIF-1α levels in senescent cells (Fig. 6A). These findings suggest that the classic mechanisms responsible for the hypoxic response may be impaired in senescent cells. Despite impaired hypoxia-induced HIF-1α expression, senescent cells up-regulated VEGF mRNA and protein secretion in response to hypoxia (Fig. 6B). Of note, the amount of VEGF secreted by senescent cells solely in response to hypoxia (∼1000 pg) exceeded that secreted by presenescent cells solely in response to hypoxia (∼400 pg) (compare Fig. 2 with Fig. 6). These results suggest that senescence may synergize with hypoxia to stimulate VEGF production. Senescence, like apoptosis, most likely evolved to prevent cancer by arresting the growth of cells in danger of becoming neoplastic. However, senescent cells may also contribute to aging and age-related disease, including late life cancer, consistent with the senescence response being an example of antagonistic pleiotropy (6Campisi J. Cell. 2005; 120: 513-522Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1765) Google Scholar). The deleterious effects of senescent cells are thought to derive from the myriad factors they secrete. These factors include matrix-degrading proteases, growth factors, and inflammatory cytokines (6Campisi J. Cell. 2005; 120: 513-522Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1765) Google Scholar, 7Roninson I.B. Cancer Lett. 2002; 179: 1-14Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar, 30Dimri G.P. Cancer Cell. 2005; 7: 505-512Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (251) Google Scholar), all of which can disrupt normal tissue homeostasis and favor cancer development. Here, we have shown that most, but not all, human and mouse fibroblast strains secrete biologically active VEGF at senescence. VEGF is a potent angiogenic factor known to be important for cancer progression (31Neri D. Bicknell R. Nat. Rev. Cancer. 2005; 5: 436-446Crossref PubMed Scopus (529) Google Scholar). We previously showed that senescent WI-38 fibroblasts promote the conversion of preneoplastic epithelial cells to malignant tumors when co-injected into immunocompromised mice (10Krtolica A. Parrinello S. Lockett S. Desprez P.Y. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 12072-12077Crossref PubMed Scopus (1131) Google Scholar). Here we have shown that tumors that develop in the presence of senescent fibroblasts are substantially more vascularized than tumors that develop in the presence of presenescent fibroblasts or in the absence of fibroblasts. Strikingly, senescent cells not only augmented the number of blood vessels/mm2 but increased their size as well. In fact, we routinely found large vessels (defined as >0.1 mm) only in tumors that developed in the presence of senescent fibroblasts. These results suggest that the presence of senescent fibroblasts may have favored tumor vascularization early on. Invasion of HUVEC cells is a prerequisite for angiogenesis. Accordingly, we found that some senescent cells, by secreting VEGF and other important factors, stimulated HUVEC to migrate and invade a basement membrane in culture. Indeed, invasion of HUVEC in the presence of a VEGF-blocking antibody suggested that senescent fibroblasts likely secrete additional angiogenic factors. Surprisingly, SDF-1, an angiogenic factor produced by tumor-associated fibroblasts (16Orimo A. Gupta P.B. Sgroi D.C. Arenzana-Seisdedos F. Delaunay T. Naeem R. Carey V.J. Richardson A.L. Weinberg R.A. Cell. 2005; 121: 335-348Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2801) Google Scholar), was not among the factors secreted by senescent WI-38 cells. Thus, although senescent and tumor-associated fibroblasts have overlapping biological effects on neighboring preneoplastic or neoplastic epithelial cells (10Krtolica A. Parrinello S. Lockett S. Desprez P.Y. Campisi J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 12072-12077Crossref PubMed Scopus (1131) Google Scholar, 15Olumi A.F. Grossfeld G.D. Hayward S.W. Carroll P.R. Tlsty T.D. Cunha G.R. Cancer Res. 1999; 59: 5002-5011PubMed Google Scholar, 16Orimo A. Gupta P.B. Sgroi D.C. Arenzana-Seisdedos F. Delaunay T. Naeem R. Carey V.J. Richardson A.L. Weinberg R.A. Cell. 2005; 121: 335-348Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2801) Google Scholar), they may use distinct mechanisms to achieve at least some of their biological effects. Quiescent WI-38 cells did not up-regulate VEGF, suggesting that elevated VEGF secretion is a senescence-associated, rather than simply growth state-associated, phenotype. Quiescence is a reversible arrested state that results in part from increased expression of p21CIP1, a cyclin-dependent kinase inhibitor and p53 transcriptional target (32Itahana K. Dimri G. Campisi J. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 2784-2791Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar, 33Sherr C.J. Roberts J.M. Genes Dev. 1999; 13: 1501-1512Crossref PubMed Scopus (5072) Google Scholar). p53 and p21CIP1 are also important for the essentially irreversible arrest of senescent cells (32Itahana K. Dimri G. Campisi J. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 2784-2791Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar, 34Collins C.J. Sedivy J.M. Aging Cell. 2003; 2: 145-150Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). In some senescent cells, including WI-38 fibroblasts, the irreversibility of the arrest is due in large measure to increased expression of a different cyclin-dependent kinase inhibitor, p16INK4a (23Beausejour C.M. Krtolica A. Galimi F. Narita M. Lowe S.W. Yaswen P. Campisi J. EMBO J. 2003; 22: 4212-4222Crossref PubMed Scopus (953) Google Scholar, 35Itahana K. Zou Y. Itahana Y. Martinez J.L. Beausejour C. Jacobs J.J. Van Lohuizen M. Band V. Campisi J. Dimri G.P. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 389-401Crossref PubMed Scopus (343) Google Scholar). Not all human fibroblast strains senesce with elevated p16INK4a levels. For example, human BJ and HCA2 foreskin fibroblasts senesce with high levels of p21CIP but undetectable levels of p16INK4a, and senescence in these cells, but not WI-38, is reversible upon inactivation of p53 (23Beausejour C.M. Krtolica A. Galimi F. Narita M. Lowe S.W. Yaswen P. Campisi J. EMBO J. 2003; 22: 4212-4222Crossref PubMed Scopus (953) Google Scholar). It is interesting, then, that VEGF levels were not elevated in senescent BJ and HCA2 cells (Fig. 3). This finding suggests that VEGF up-regulation is not common to all senescent fibroblasts and might depend on whether the p16INK4a/pRB pathway is engaged at senescence. Consistent with this idea, early passage WI-38 increased VEGF secretion following ectopic overexpression of p16INK4a or oncogenic RAS, which requires p16INK4a for its ability to induce senescence (36Drayton S. Rowe J. Jones R. Vatcheva R. Cuthbert-Heavens D. Marshall J. Fried M. Peters G. Cancer Cell. 2003; 4: 301-310Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar). We also found that the senescence-associated increase in VEGF production was not accompanied by a commensurate increase in HIF-1α, the major transcription factor that up-regulates VEGF in response to hypoxia (25Tonini T. Rossi F. Claudio P.P. Oncogene. 2003; 22: 6549-6556Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). This finding suggests that VEGF up-regulation by senescent cells is not due to classic hypoxic response mechanisms. Moreover, under hypoxic conditions, we found that senescent cells failed to induce HIF-1α, in contrast to presenescent cells, which induced HIF-1α to high levels. Nonetheless, senescent cells up-regulated VEGF in response to hypoxia, and this response synergized with the senescent-associated increase in VEGF secretion. At present, we do not know whether the slightly increased basal levels of HIF-1α in normoxia is responsible for the senescence-associated increase in VEGF or whether other mechanisms, such as diminished expression of Von Hippel-Lindau, or direct activation of HIF-1α by pRB (37Budde A. Schneiderhan-Marra N. Petersen G. Brune B. Oncogene. 2005; 24: 1802-1808Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar, 38Giaccia A.J. Simon M.C. Johnson R. Genes Dev. 2004; 18: 2183-2194Crossref PubMed Scopus (286) Google Scholar), are responsible. Whatever the mechanism by which senescent cells up-regulate VEGF, our findings provide an additional and potentially important mechanism by which senescent human stromal cells might stimulate cancer progression, namely, up-regulation of angiogenic factors such as VEGF. We thank Lawrence Kolnic for help with the tissue section staining.

DNA damage can induce a tumor suppressive response termed cellular senescence. Damaged senescent cells permanently arrest growth, secrete inflammatory cytokines and other proteins and harbor persistent nuclear foci that contain DNA damage response (DDR) proteins. To understand how persistent damage foci differ from transient foci that mark repairable DNA lesions, we identify sequential events that differentiate transient foci from persistent foci, which we term ‘DNA segments with chromatin alterations reinforcing senescence’ (DNA-SCARS). Unlike transient foci, DNA-SCARS associate with PML nuclear bodies, lack the DNA repair proteins RPA and RAD51, lack single-stranded DNA and DNA synthesis and accumulate activated forms of the DDR mediators CHK2 and p53. DNA-SCARS form independently of p53, pRB and several other checkpoint and repair proteins but require p53 and pRb to trigger the senescence growth arrest. Importantly, depletion of the DNA-SCARS-stabilizing component histone H2AX did not deplete 53BP1 from DNA-SCARS but diminished the presence of MDC1 and activated CHK2. Furthermore, depletion of H2AX reduced both the p53-dependent senescence growth arrest and p53-independent cytokine secretion. DNA-SCARS were also observed following severe damage to multiple human cell types and mouse tissues, suggesting that they can be used in combination with other markers to identify senescent cells. Thus, DNA-SCARS are dynamically formed distinct structures that functionally regulate multiple aspects of the senescent phenotype.

AbstractThe polycomb protein Bmi-1 represses the INK4a locus, which encodes the tumor suppressors p16 and p14ARF. Here we report that Bmi-1 is downregulated when WI-38 human fibroblasts undergo replicative senescence, but not quiescence, and extends replicative life span when overexpressed. Life span extension by Bmi-1 required the pRb, but not p53, tumor suppressor protein. Deletion analysis showed that the RING finger and helix-turn-helix domains of Bmi-1 were required for life span extension and suppression of p16. Furthermore, a RING finger deletion mutant exhibited dominant negative activity, inducing p16 and premature senescence. Interestingly, presenescent cultures of some, but not all, human fibroblasts contained growth-arrested cells expressing high levels of p16 and apparently arrested by a p53- and telomere-independent mechanism. Bmi-1 selectively extended the life span of these cultures. Low O2 concentrations had no effect on p16 levels or life span extension by Bmi-1 but reduced expression of the p53 target, p21. We propose that some human fibroblast strains are more sensitive to stress-induced senescence and have both p16-dependent and p53/telomere-dependent pathways of senescence. Our data suggest that Bmi-1 extends the replicative life span of human fibroblasts by suppressing the p16-dependent senescence pathway. ACKNOWLEDGMENTSThis work was supported by grants from the National Institutes of Health (AG09909 to J.C. and AG16851 to G.P.D.) and startup funds from the Cancer Center, New England Medical Center, Boston, Mass. (G.P.D.).We thank Miguel Rubio for providing near-senescent 82-6 cells.

Cellular senescence irreversibly arrests cell proliferation in response to oncogenic stimuli. Human cells develop a senescence-associated secretory phenotype (SASP), which increases the secretion of cytokines and other factors that alter the behavior of neighboring cells. We show here that “senescent” mouse fibroblasts, which arrested growth after repeated passage under standard culture conditions (20% oxygen), do not express a human-like SASP, and differ from similarly cultured human cells in other respects. However, when cultured in physiological (3%) oxygen and induced to senesce by radiation, mouse cells more closely resemble human cells, including expression of a robust SASP. We describe two new aspects of the human and mouse SASPs. First, cells from both species upregulated the expression and secretion of several matrix metalloproteinases, which comprise a conserved genomic cluster. Second, for both species, the ability to promote the growth of premalignant epithelial cells was due primarily to the conserved SASP factor CXCL-1/KC/GRO-α. Further, mouse fibroblasts made senescent in 3%, but not 20%, oxygen promoted epithelial tumorigenesis in mouse xenographs. Our findings underscore critical mouse-human differences in oxygen sensitivity, identify conditions to use mouse cells to model human cellular senescence, and reveal novel conserved features of the SASP.