Abstract The main obstacle in eradicating tuberculosis is the ability of Mycobacterium tuberculosis to remain dormant in the host, and then to get reactivated even years later under immuno-compromised conditions. Transcriptional regulation in intracellular pathogens plays an important role in adapting to the challenging environment inside the host cells. Previously, we demonstrated that Rv1019, a putative transcriptional regulator of M. tuberculosis H37Rv, is an autorepressor. We showed that, Rv1019 is cotranscribed with Rv1020 ( mfd ) and Rv1021 ( mazG ) encoding DNA repair proteins and negatively regulates the expression of these genes. In the present study, we show that Rv1019 also regulates the expression of the genes Rv3230c and Rv3229c ( desA3 ) which form a two-gene operon in M. tuberculosis . Constitutive expression of Rv1019 in M. tuberculosis significantly downregulated the expression of these genes. Employing Wayne’s hypoxia-induced dormancy model of M. tuberculosis , we show that Rv1019 is upregulated (3-fold) under hypoxia. Finally, by reporter assay, using M. smegmatis as a model, we validate that Rv1019 is recruited to the promoter of Rv3230c-Rv3229c during hypoxia and negatively regulates this operon which is involved in the biosynthesis of oleic acid.

Regulation of gene expression at the level of transcription is one of the ways living organisms differentially make proteins in their cells. Intracellular pathogen Mycobacterium tuberculosis persists in the host for years in a latent state in structures called granuloma. Rv1019, a member of an uncharacterized TetR family of transcriptional regulators of Mtb H37Rv, was found to be differentially expressed during dormancy and reactivation in vitro. By GFP reporter assays, electrophoretic mobility shift assays and chromatin immuno-precipitation assays we showed that this protein binds to its own promoter and acts as a negative regulator of its own expression. It forms dimers in vitro which is essential for the DNA binding activity, which is abrogated in the presence of tetracycline. We show that Rv1019 and downstream genes Rv1020 (mfd), Rv1021 (mazG) are co-transcribed. Constitutive expression of Rv1019 in M. smegmatis downregulated MSMEG\_5423 (mfd) and MSMEG\_5422 (mazG) suggesting that Rv1019 negatively regulates these downstream genes. M. smegmatis expressing Rv1019 was found to be sensitive to UV and H2O2 compared to the control suggesting its role in regulating DNA damage response in mycobacterium.

Abstract Downregulation of host gene expression is one of the key strategies adopted by intracellular pathogens such as Mycobacterium tuberculosis (MTB) for their survival and subsequent pathogenesis. In a previous study, we have shown that HDAC1 levels go up in macrophages infected with MTB and it hypoacetylates histone H3 at the promoter of IL-12B gene leading to its downregulation. Here we show that after infection with MTB, the levels of the phosphorylated form of HDAC1 increase significantly in macrophages. Employing immunoprecipitation and LC-MS/MS, we found transcriptional repressor protein ZBTB25 associates with HDAC1 silencing complex along with transcriptional corepressor Sin3a. By chromatin immunoprecipitation and PCR analyses, we found that phosphorylated HDAC1, Sin3a, and ZBTB25 are recruited to the promoter of IL-12B to downregulate its expression in infected macrophages. Knocking down of ZBTB25 enhanced release of IL-12p40 from infected macrophages. Interestingly, the treatment of infected macrophages with CI994 (inhibitor of HDAC1) or dithiopyridine (inhibitor of ZBTB25) promoted the colocalization of LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3, a marker for autophagy) and MTB in autophagosomes. Induction of autophagy resulted in the killing of intracellular MTB. Enhanced phosphorylation of JAK2 and STAT4 was observed in macrophages upon CI994 and dithiopyridine treatment, and inhibition of JAK2/STAT4 negated the killing of intracellular mycobacteria suggesting a possible role of these proteins in the autophagy-mediated killing of intracellular MTB.