With the aim of identifying novel regulators of adipocyte differentiation, we have cloned and characterized preadipocyte factor 1 (pref-1), a novel member of the epidermal growth factor (EGF)-like family of proteins. Pref-1 is synthesized as a transmembrane protein with six tandem EGF-like repeats. In preadipocytes, multiple discrete forms of pref-1 protein of 45–60 kd are present, owing in part to N-linked glycosylation. While pref-1 mRNA is abundant in preadipocytes, its expression is completely abolished during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes to adipocytes. Moreover, constitutive expression of pref-1 in preadipocytes, which in effect blocks its down-regulation, drastically inhibits adipose differentiation. This indicates that pref-1 functions as a negative regulator of adipocyte differentiation, possibly in a manner analogous to EGF-like proteins that govern cell fate decisions in invertebrates.

Impaired insulin-mediated suppression of hepatic glucose production (HGP) plays a major role in the pathogenesis of type 2 diabetes (T2D), yet the molecular mechanism by which this occurs remains unknown. Using a novel in vivo metabolomics approach, we show that the major mechanism by which insulin suppresses HGP is through reductions in hepatic acetyl CoA by suppression of lipolysis in white adipose tissue (WAT) leading to reductions in pyruvate carboxylase flux. This mechanism was confirmed in mice and rats with genetic ablation of insulin signaling and mice lacking adipose triglyceride lipase. Insulin’s ability to suppress hepatic acetyl CoA, PC activity, and lipolysis was lost in high-fat-fed rats, a phenomenon reversible by IL-6 neutralization and inducible by IL-6 infusion. Taken together, these data identify WAT-derived hepatic acetyl CoA as the main regulator of HGP by insulin and link it to inflammation-induced hepatic insulin resistance associated with obesity and T2D.

We have used rat cDNA microarrays to identify adipocyte-specific genes that could play an important role in adipocyte differentiation or function. Here, we report the cloning and identification of a 2.0-kb mRNA coding for a putative protein that we have designated as desnutrin. The novel gene is expressed predominantly in adipose tissue, and its expression is induced early during 3T3-L1 adipocyte differentiation. Desnutrin mRNA levels were regulated by the nutritional status of animals, being transiently induced during fasting. In vitro desnutrin gene expression was up-regulated by dexamethasone in a dose-dependent manner but not by cAMP, suggesting that glucocorticoids could mediate the increase in desnutrin mRNA levels observed during fasting. Desnutrin mRNA codes for a 486-amino acid putative protein containing a patatin-like domain, characteristic of many plant acyl hydrolases belonging to the patatin family. Confocal microscopy of enhanced green fluorescent protein-tagged desnutrin protein-transfected cells showed that the fusion protein localized in the cytoplasm. Moreover, cells overexpressing desnutrin by transfection showed an increase in triglyceride hydrolysis. Interestingly, we also found that the desnutrin gene expression level was lower in ob/ob and db/db obese mouse models. Overall, our data suggest that the newly identified desnutrin gene codes for an adipocyte protein that may function as a lipase and play a role in the adaptive response to a low energy state, such as fasting, by providing fatty acids to other tissues for oxidation. In addition, decreased expression of desnutrin in obesity models suggests its possible contribution to the pathophysiology of obesity.

A 12.5-kDa cysteine-rich adipose tissue-specific secretory factor (ADSF/resistin) is a novel secreted protein rich in serine and cysteine residues with a unique cysteine repeat motif of CX12CX8CXCX3CX10CXCXCX9CC. A single 0.8-kilobase mRNA coding for this protein was found in various murine white adipose tissues including inguinal and epididymal fats and also in brown adipose tissue but not in any other tissues examined. Two species of mRNAs with sizes of 1.4 and 0.8 kilobases were found in rat adipose tissue. Sequence analysis indicates that this is because of two polyadenylation signals, the proximal one with the sequence AATACA with a single base mismatch from murine AATAAA and the distal consensus sequence AATAAA. The mRNA level was markedly increased during 3T3-L1 and primary preadipocyte differentiation into adipocytes. Its expression in adipose tissue is under tight nutritional and hormonal regulation; the mRNA level was very low during fasting and increased 25-fold when fasted mice were refed a high carbohydrate diet. It was also very low in adipose tissue of streptozotocin-diabetes and increased 23-fold upon insulin administration. Upon treatment with the conditioned medium from COS cells transfected with the expression vector, conversion of 3T3-L1 cells to adipocytes was inhibited by 80%. The regulated expression pattern suggesting this factor as an adipose sensor for the nutritional state of the animals and the inhibitory effect on adipocyte differentiation implicate its function as a feedback regulator of adipogenesis. A 12.5-kDa cysteine-rich adipose tissue-specific secretory factor (ADSF/resistin) is a novel secreted protein rich in serine and cysteine residues with a unique cysteine repeat motif of CX12CX8CXCX3CX10CXCXCX9CC. A single 0.8-kilobase mRNA coding for this protein was found in various murine white adipose tissues including inguinal and epididymal fats and also in brown adipose tissue but not in any other tissues examined. Two species of mRNAs with sizes of 1.4 and 0.8 kilobases were found in rat adipose tissue. Sequence analysis indicates that this is because of two polyadenylation signals, the proximal one with the sequence AATACA with a single base mismatch from murine AATAAA and the distal consensus sequence AATAAA. The mRNA level was markedly increased during 3T3-L1 and primary preadipocyte differentiation into adipocytes. Its expression in adipose tissue is under tight nutritional and hormonal regulation; the mRNA level was very low during fasting and increased 25-fold when fasted mice were refed a high carbohydrate diet. It was also very low in adipose tissue of streptozotocin-diabetes and increased 23-fold upon insulin administration. Upon treatment with the conditioned medium from COS cells transfected with the expression vector, conversion of 3T3-L1 cells to adipocytes was inhibited by 80%. The regulated expression pattern suggesting this factor as an adipose sensor for the nutritional state of the animals and the inhibitory effect on adipocyte differentiation implicate its function as a feedback regulator of adipogenesis. CCAAT enhancer-binding protein α adipose tissue-specific secretory factor preadipocyte factor-1 fetal bovine serum dexamethasone methylisobutylxanthine fatty acid synthase peroxisome proliferator-activated receptor γ adipocyte fatty acid-binding protein stearoyl CoA desaturase Dulbecco's modified Eagle's medium thiazolidinediones base pairs nucleotide hemagglutinin polymerase chain reaction reverse transcriptase PCR expressed sequence tag Adipose tissue is the major energy reservoir in higher eukaryotes; storing triacylglycerol in periods of energy excess and its mobilization during energy shortage are its primary purposes. During adipose tissue development, genes that code for the lipid transport and lipogenic and lipolytic enzymes are induced to carry out the adipocyte function of triacylglycerol synthesis, storage, and mobilization. For the past decades, in vitro systems including preadipocyte cell lines such as 3T3-L1 cells as well as primary preadipocytes in culture have been extensively used (1Gregoire F.M. Smas C.M. Sul H.S. Physiol. Rev. 1998; 78: 783-809Crossref PubMed Scopus (1873) Google Scholar, 2Green H. Kehinde O. Cell. 1976; 7: 105-113Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (616) Google Scholar, 3Wienderer L. Loffler G. J. Lipid Res. 1987; 28: 649-658Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Transcriptional activation of adipocyte genes has been the focus of much research. CCAAT enhancer-binding protein (C/EBPα)1 and PPARγ have been shown to be critical in directing adipocyte-specific gene expression and adipogenesis (4Christy R.J. Yang V.W. Ntambi J.M. Geiman D.E. Landschulz W.H. Friedman A.D. Nakabeppu Y. Kelly T.J. Lane M.D. Genes Dev. 1989; 3: 1323-1335Crossref PubMed Scopus (467) Google Scholar, 5Umek R.M. F Friedman A.D. McKnight S.L. Science. 1991; 251: 288-292Crossref PubMed Scopus (573) Google Scholar, 6Tontonoz P.E. Hu E. Graves R.A. Budavari A.I. Spiegelman B.M. Genes Dev. 1994; 8: 1224-1234Crossref PubMed Scopus (2005) Google Scholar, 7Brun R.P. Tontonoz P. Forman B.M. Ellis R. Chen J. Evans R.M. Spiegelman B.M. Genes Dev. 1996; 10: 974-984Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar). In animals, the activities of critical enzymes in triacylglycerol biosynthesis and lipolysis are tightly controlled by nutritional and hormonal conditions (8Joseph D. Paulauskis J.D. Sul H.S. J. Biol. Chem. 1989; 264: 574-577Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). For example, feeding causes an induction whereas fasting causes suppression of lipogenic enzymes. Elevated insulin over a high carbohydrate diet feeding is thought to induce these enzymes in lipogenesis. The role of insulin can also be demonstrated by administration of insulin to diabetic animals. These enzymes have also been shown to be expressed at a high level in the adipose tissue of animal obesity models including ob/ob and db/db mice as well as Zucker rats (9Penicaud L. Ferre P. Assimacopoulos-Jeannet F. Perdereau D. Leturque A. Jeanrenaud B. Picon L. Girard J. Biochem. J. 1991; 279: 303-308Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar). Hyperinsulinemia may be responsible for elevated levels of the enzymes. The role of adipose tissue mainly as an organ for energy storage and mobilization has recently been expanded by the discovery of leptin (10Zhang Y. Proenca R. Maffei M. Barone M. Leopold L. Friedman J.M. Nature. 1994; 372: 425-432Crossref PubMed Scopus (11807) Google Scholar,11Halaas J.L. Gajiwala K.S. Maffei M. Cohen S.L. Chait B.T. Rabinowitz D. Lallone R.L. Burley S.K. Friedman J.M. Science. 1995; 269: 543-546Crossref PubMed Scopus (4256) Google Scholar). Leptin is primarily made and secreted by mature adipocytes. It binds to its receptor in the hypothalamus and may function in regulating body fat mass (12Maffei M. Fei H. Lee G.H. Dani C. Leroy P. Zhang Y. Proenca R. Negrel R. Ailhaud G. Friedman J.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 6957-6960Crossref PubMed Scopus (420) Google Scholar, 13Hotamisligil G.S. Spiegelman B.M. Science. 1996; 271: 665-668Crossref PubMed Scopus (2223) Google Scholar). Other immune system-related proteins such as TNF-α, adipsin, and ACRP30/AdipoQ along with vascular function-related molecules such as angiotensinogen and plasminogen activator inhibitor type I have been shown to be secreted by adipose tissue (14Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar, 15He E. Liang P. Spiegelman B.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10697-10703Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1901) Google Scholar, 16Shimomura L.T. Funahashi M. Takahashi K. Maeda K. Kotani T. Nakamura S. Yamashita M. Miura Y. Fukuda K. Takemura K. Tokunaga K. Matsuzawa Y. Nat. Med. 1996; 2: 800-803Crossref PubMed Scopus (823) Google Scholar). In addition, adipocytes also secrete factors such as Pref-1, which inhibits adipocyte differentiation (17Smas C.M. Chen L. Sul H.S. Mol. Cell. Biol. 1997; 17: 977-988Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar, 18Smas C.M. Sul H.S. Cell. 1993; 73: 725-734Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (564) Google Scholar, 19Smas C.M. Kachinskas D. Liu C.-M. Xie X. Dircks L.K. Sul H.S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 31751-31758Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (64) Google Scholar). Although the precise functions of these molecules are not clear, adipose tissue as a secretory organ to regulate other physiological processes as well as energy balance and homeostasis is now well established. Adipose tissue must secrete factors reflecting the nutritional status and regulating adipose tissue mass. We report here the identification and function of a serine/cysteine-rich adipocyte-specificsecretory factor (ADSF) that does not belong to known classes of cysteine-rich proteins. Its mRNA is expressed only in adipose tissue. The mRNA is induced markedly during differentiation of 3T3-L1 and primary preadipocytes. In fasted or diabetic animals, its expression is very low or non-detectable in adipose tissue but increases markedly upon feeding or insulin administration. Furthermore, when treated with the conditioned medium from COS cells transfected with the expression vector, adipose conversion of 3T3-L1 cells was inhibited, indicating its potential role as a feedback regulator of adipogenesis. During the submission of this manuscript, the Lazar laboratory (20Steppan C.M. Balley S.T. Bhat S. Brown E.J. Banerjee R.R. Wright C.M. Patel H.R. Ahima R.S. Lazar M.A. Nature. 2001; 409: 307-312Crossref PubMed Scopus (4004) Google Scholar) reported this protein as a TZD down-regulated factor contributing to insulin resistance. Adipose tissue-specific genes were examined by microarray analysis using rat Genefilter membranes (Research Genetics). Filters were hybridized with α-33P-labeled cDNAs synthesized with 5 μg of total RNA. Spots exclusively hybridized with cDNA probes prepared from adipose tissue RNA were used for sequence analysis. Mice were fasted for 48 h, or fasted mice were refed a 58% carbohydrate fat-free diet (21Moon Y.S. Latasa M.J. Kim K.-H. Wang D. Sul H.S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 10121-10127Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar). Induction of diabetes and insulin treatments were carried out as described previously (21Moon Y.S. Latasa M.J. Kim K.-H. Wang D. Sul H.S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 10121-10127Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar). A hemagglutinin (HA)-tagged full-length mouse ADSF/resistin fragment was prepared by PCR amplification. The 5′ primer, 5′-TGGGACAGGAGCTAATACCCAGA-3′ and 3′ primer, 5′-GTCAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATAGGAAGCGACCTGCAGCTT-3′ were used. The resultant PCR product was originally ligated into pCR3.1 (Invitrogen), and a BamHI-XhoI fragment was then subcloned into pcDNA3.1 (Invitrogen). The sequence of the resultant plasmid was confirmed by restriction mapping and sequencing. 3T3-L1 preadipocytes were maintained in DMEM containing 10% FBS. For adipocyte differentiation, confluent cells were treated with 1 μm Dex and 0.5 mm MIX as described previously (22Rubin C.S. Hirsch A. Fung C. Rosen O.M. J. Biol. Chem. 1978; 253: 7570-7578Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). For experiments in which conditioned medium was used, cells were cultured in medium composed of 75% conditioned medium and 25% DMEM, 10% FBS plus Dex and MIX. The adipose-derived stromal vascular fractions from rats were prepared as has been described previously (23Gregoire F.M. Johnson P.R. Greenwood M.R. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 1995; 19: 664-670PubMed Google Scholar). Briefly, the subcutaneous inguinal fat deposits from female Zuker rats were dissected and the lymph nodes were removed. The stromal vascular cells were obtained by collagenase (Sigma, 540 units/mg) digestion at 1 mg/ml at 37 °C for 45 min in Hepes-phosphate buffer (10 mm HEPES, pH 7.4, 135 mm NaCl, 2.2 mm CaCl2, 1.25 mm MgSO4, 0.45 mmKH2PO4, 2.17 mmNa2HPO4, 5 mmd-glucose, and 2% w/v bovine serum albumin). The cell suspension was filtered through a 100-μm nylon filter and centrifuged at 400 × g for 10 min. The pellets were washed, filtered through a 25-μm nylon filter, and plated at a density of 2.5 × 104 cells/cm2 in DMEM, 10% FBS. At confluence, differentiation was initiated by the addition of 0.1 μm Dex, 0.25 mm MIX, and 17 nminsulin. After 2 days, the medium was replaced by DMEM, 10% FBS plus insulin only. The pcDNA3.1 expression vector was transiently transfected into COS cells using DEAE-dextran in DMEM with 10% serum plus (JRH Biosciences) as described previously (24Gulick T. Ausubel F.M. Brent R. Kingston R.E. Moore D.D. Seidman J.G. Smith J.A. Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., New York1996: 9201-9210Google Scholar). Twenty-four hours after transfection, the medium was changed to DMEM supplemented with 10% FBS. The conditioned medium was collected 72 h after transfection, centrifuged at 500 × g for 5 min, and stored at 4 °C for less than a week before use. The total RNA from the rat tissues was prepared by guanidine isothiocyanate/cesium chloride centrifugation. The total RNA from the cells was prepared using TriZOL reagent (Life Technologies, Inc.). RNA was electrophoresed in 1% formaldehyde-agarose gel in 2.2 m formaldehyde, 20 mm MOPS, 1 mm EDTA, and transferred to Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech). After UV cross-linking, the membranes were hybridized with the α-32P-labeled cDNA probes in ExpressHyb solution (CLONTECH). The membranes were exposed to x-ray film with an intensifying screen, and the signals were scanned using the Molecular Analyst (Bio-Rad). Cells were lysed in a buffer containing 50 mm Tris-HCl, pH 8.0, 120 mm NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mm EDTA, and 2 mmphenylmethylsulfonyl fluoride for 30 min on ice. The protein content was determined by Bradford assay (Bio-Rad). Thirty μg of protein were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, electroblotted onto Immobilon polyvinylidene difluoride membranes (Millipore), and immunodetected using mouse anti-HA antiserum (Covance) and goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase conjugate (Bio-Rad) by using an enhanced chemiluminescence detection kit (Bio-Rad). RNA was reverse transcribed at 37 °C for 60 min, and the products were used as the template for two PCR reactions in one tube containing target genes with actin as an internal control. The primers used were PPARγ (PCR product of 375 bp in length), 5′-ATGCCATTCTGGCCCACCAAC-3′ and 5′-CCTTGCATCCTTCCAAAGCAT-3′; aFABP (PCR product of 310 bp in length) 5′-CTTGTCTCCAGTGAAAACTT-3′ and 5′-ACCTTCTCGTTTTCTTTAT-3′; FAS (PCR product of 120 bp in length), 5′-AGGGGTCGACCTGGTCCTCA-3′ and 5′-GGGTGGTTGTTAGAAAGAT-3′; and actin (PCR product of 282 bp in length), 5′-TCCTATGTGGGTGACGAGGC-3′ and 5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGG-3′. To identify novel genes that are only expressed in adipocytes and are induced during adipocyte differentiation, we compared expression levels of rat expressed sequence tag (EST) sequences by cDNA microarray. RNA samples were prepared from white adipose tissue as well as brown adipose tissue, liver, muscle, and brain. The RNAs were used to synthesize cDNAs for hybridization, and those sequences that were expressed only in white and brown adipose tissues were identified. Candidate EST clones were sequenced, and one such sequence was identified as that coding for a novel adipose tissue-specific, serine- and cysteine-rich secreted protein. This gene was originally named as FIZZ3, which belongs to a gene family whose founding member, FIZZ1, is implicated as a possible mediator of neuronal function and airway hyperactivity (25Holcomb I.N. Kabakoff R.C. Chan B. Baker T.W. Gurney A. Henzel W. Nelson C. Lowman H.B. Wright B.D. Skelton N.J. Frantz G.D. Tumas D.B Peale F.V. Shelton D.L. Hebert C.C. EMBO J. 2000; 19: 4046-4055Crossref PubMed Scopus (608) Google Scholar). While this manuscript was being reviewed, the protein was also identified as a TZD down-regulated adipocyte protein, resistin, which may contribute to insulin resistance (20Steppan C.M. Balley S.T. Bhat S. Brown E.J. Banerjee R.R. Wright C.M. Patel H.R. Ahima R.S. Lazar M.A. Nature. 2001; 409: 307-312Crossref PubMed Scopus (4004) Google Scholar). From now on, we refer to the novel serine/cysteine-rich adipocyte-specific secretory factor as ADSF/resistin. The cDNA sequence of rat ADSF/resistin is shown in Fig.1 A. It reveals a 1174-bp cDNA with two potential polyadenylation signal sequences, the proximal one at 524 nt and the distal one at 1149 nt. Northern blot analysis revealed two mRNAs with sizes of 1.4 and 0.8 kb found in rat adipose tissue with the differences in size attributed to the 3′-untranslated region. In murine fat tissues, on the other hand, we detected only one mRNA, which corresponds to the shorter rat mRNA. When we sequenced murine cDNA, we found that unlike the rat cDNA, the mouse homolog was shorter in the 3′-untranslated region with only one polyadenylation signal sequence corresponding to the rat promixal sequence. The mRNA species detected in Northern blot analysis and sequence analysis indicate that the difference in the size of rat and murine mRNAs is in the 3′-untranslated region. Interestingly, mouse cDNA sequence contains a consensus polyadenlylation signal AATAAA. In contrast, rat cDNA sequence reveals the proximal polyadenylation signal AATACA, with a single base mismatch, which probably is a weak signal and therefore causes the generation of the longer mRNA using the distal polyadenylation signal of AATAAA. Overall between rat and murine sequences there is 68% homology in nucleotide sequence (85 and 43% in coding and noncoding regions, respectively). The open reading frame encodes a 114 amino acid protein with a calculated molecular mass of 12.5 kDa and 75% homology between the rat and murine sequence (Fig. 1 B). One hydrophobic stretch is predicted by a Kyte-Doolittle plot located within the first 20 amino-terminal residues and is characteristic of a signal sequence. To test whether this protein is secreted, we constructed a HA epitope-tagged expression vector and transiently transfected it into COS cells. Western blot analysis demonstrated that the COS cells synthesized a protein with a molecular weight corresponding to the in vitro synthesized protein, and the secreted protein was detected in the conditioned medium (Fig.1 C). The most striking structural feature is the presence of multiple serines and cysteines, each comprising ∼10% of the amino acid residues with a coiled-coil structure. Although there are several classes of cysteine-rich protein motifs, the spacing of the cysteines, CX12CX8CXCX3CX10CXCXCX9CC, does not match the known classes of cysteine-rich proteins. However, the cyteine-rich motif predicts possible protein-protein interaction. We examined the tissue distribution of the mRNA by Northern blot analysis using various tissues from both mice and rats (Fig.2 A). As indicated above, two mRNA species of 1.4 and 0.8 kb were present only in rat adipose tissue but not in any other tissues examined including brain, heart, small intestine, kidney, liver, lung, and skeletal muscle. A single 0.8-kb mRNA was detected only in murine adipose tissue (data not shown). We also detected the two mRNAs at similar levels in all regions of rat white adipose tissues including epididymal and inguinal fat pads. Interestingly, these mRNAs were also found in brown adipose tissue although in lesser amounts than in white adipose tissue. We next fractionated adipose tissue into stromal vascular fractions, which mainly contain preadipocytes and adipocyte fractions. We found that unlike in adipocyte fractions, these mRNAs were not detectable in stromal vascular fractions suggesting that ADSF/resistin expression may be induced during adipogenesis. To determine whether ADSF/resistin expression is regulated during adipocyte differentiation, mRNA levels were examined in 3T3-L1 preadipocytes during differentiation into adipocytes (Fig. 2 B). The ADSF/resistin mRNA was not detectable in the preadipocyte stage (Day 0). But levels of the 0.8-kb murine mRNA, as predicted by the murine origin of 3T3-L1 cells, were markedly increased during differentiation into adipocytes. As anticipated, expression of aFABP (aP2) was induced during adipose conversion, whereas actin expression was decreased by ∼50%. We also carried out in vitro differentiation of stromal vascular cells isolated from rat adipose tissue. Differentiation of adipose precursor cells isolated from the epididymal fat pads may better mimicin vivo processes of adipogenesis. Two species (1.4 and 0.8 kb) of rat mRNAs were undetectable in freshly plated preadipocytes of stromal vascular fractions, but their expression was increased dramatically during adipose conversion initiated by Dex and MIX treatment. The increase in mRNA levels during adipogenesis of both 3T3-L1 and primary preadipocytes was similar to or somewhat later than that of other late adipocyte markers, such as adipocyte fatty acid-binding protein and stearyl CoA reductase. The results of 3T3-L1 and primary preadipocytes in culture along with its tissue distribution clearly show that the mRNA levels increase during late stages of adipose tissue development, and therefore ADSF/resistin is expressed only in adipose tissue in mature rodents. To understand the mode of regulation of ADSF/resistin expression in adipose tissue, we examined mRNA levels following dietary and hormonal treatments. As shown in Fig. 3 A, the mRNA levels were quite low when mice were fasted. Upon refeeding a high carbohydrate fat-free diet, the mRNA levels increased 25-fold after 16 h. Likewise, FAS mRNA levels increased by 34-fold with the same dietary treatment that favors lipogenesis. Nutritional manipulation of fasting/refeeding causes an increased circulation of insulin. We tested whether the observed increase in mRNA levels during fasting/refeeding is caused by an increase in insulin secretion. We utilized streptozotocin-diabetic mice. The mRNA levels were low in the adipose tissue of diabetic mice (Fig. 3 B). Upon insulin administration, the mRNA level was increased 23-fold after 30 min. As predicted, FAS mRNA levels increased 15-fold after 30 min. Actin mRNA levels did not change appreciably by fasting/refeeding or by diabetes/insulin administration. These results indicate that ADSF/resistin is regulated in a fashion similar to the lipogenic enzyme, fatty acid synthase. However, unlike the lipogenic enzymes, which are induced both in liver and adipose tissue during feeding and by insulin, ADSF/resistin is expressed only in adipose tissue and induced by nutrition and insulin. Given that it is expressed only in adipose tissue and highly induced when the animals are in a fed state, we predicted that ADSF/resistin might promote adipoconversion of preadipocytes. Our hypothesis is that this protein may be a signal to generate adipocytes for the increased capacity to store excess energy. We collected medium from COS cells transfected with expression vector containing HA-tagged full-length mouse cDNA. The conditioned medium was added to differentiating 3T3-L1 cells to test their effect on adipogenesis. 3T3-L1 cells maintained in conditioned medium collected from COS cells transiently transfected with control vector differentiated into lipid-laden adipocytes as shown in oil red O staining (Fig.4 A). Unexpectedly, those cells maintained in medium from COS cells transfected with HA-tagged expression vector did not undergo extensive adipose conversion as judged by lipid staining. Similarly, expression of adipocyte markers, PPARγ, aFABP, and fatty acid synthase was decreased by 80% when cells were treated with conditioned medium from COS cells transfected with HA-tagged expression vector (Fig. 4 B). The actin mRNA level of these cells was somewhat higher, as expected. These results clearly demonstrate an inhibitory effect of ADSF/resistin on adipose conversion. Mature adipocytes, the main cellular components of adipose tissue, are uniquely equipped to function in energy storage and balance under tight hormonal control. However, with the recent realization that adipocytes secrete factors known to play a role in appetite control, immune response, and vascular disease, a much more complex and dynamic role for adipose tissue has emerged. The best known example is leptin, a hormone that is primarily made and secreted by mature adipocytes to regulate adipose fat mass. However, several adipocyte-specific factors with unknown functions including adipsin, acylation stimulation protein, and Acrp30/AdipoQ are secreted along with other well understood factors such as TNF-α, angiotensinogen, and plasminogen activator inhibitor type-I. Most of these factors appear to be related to immune or vascular functions. These examples clearly establish that the adipocytes behave as endocrine as well as paracrine/autocrine cells. The exact role of the ADSF/resistin secreted from adipose tissue is not yet known. It is composed of cysteine-rich domain with unique cysteine spacing and may potentially participate in protein-protein interaction. It is exclusively made in adipose tissue and is secreted to the medium. Its exclusive expression in adipocytes, its large increase during the late stage of adipogenesis, and its dramatic induction during fasting/refeeding and by insulin administration to streptozotocin-diabetic animals suggest that this factor may be involved in sensing the nutritional status of the animals to affect adipogenesis. Some of these properties are most similar to those observed with leptin, which is secreted only by adipocytes and is induced dramatically by fasting/refeeding and by diabetes/insulin. We speculate that this factor may be a molecule that serves as a feedback signal to restrict adipose tissue formation. It is also possible that it functions in an opposite manner to known differentiation agents such as Dex, MIX, and insulin during adipocyte differentiation The recent report of ADSF/resistin as a TZD down-regulated adipose tissue factor, which may antagonize insulin action by linking obesity to diabetes, is also intriguing and needs further study.

While fatty acids (FAs) released by white adipose tissue (WAT) provide energy for other organs, lipolysis is also critical in brown adipose tissue (BAT), generating FAs for oxidation and UCP-1 activation for thermogenesis. Here we show that adipose-specific ablation of desnutrin/ATGL in mice converts BAT to a WAT-like tissue. These mice exhibit severely impaired thermogenesis with increased expression of WAT-enriched genes but decreased BAT genes, including UCP-1 with lower PPARα binding to its promoter, revealing the requirement of desnutrin-catalyzed lipolysis for maintaining a BAT phenotype. We also show that desnutrin is phosphorylated by AMPK at S406, increasing TAG hydrolase activity, and provide evidence for increased lipolysis by AMPK phosphorylation of desnutrin in adipocytes and in vivo. Despite adiposity and impaired BAT function, desnutrin-ASKO mice have improved hepatic insulin sensitivity with lower DAG levels. Overall, desnutrin is phosphorylated/activated by AMPK to increase lipolysis and brings FA oxidation and UCP-1 induction for thermogenesis.

Preadipocyte factor 1 (Pref-1/Dlk1) inhibits in vitro adipocyte differentiation and has been recently reported to be a paternally expressed imprinted gene at human chromosome 14q32.Studies on human chromosome 14 deletions and maternal uniparental disomy (mUPD) 14 suggest that misexpression of a yet-to-be-identified imprinted gene or genes present on chromosome 14 causes congenital disorders.We generated Pref-1 knockout mice to assess the role of Pref-1 in growth and in vivo adipogenesis and to determine the contribution of Pref-1 in mUPD.Pref-1-null mice display growth retardation, obesity, blepharophimosis, skeletal malformation, and increased serum lipid metabolites.Furthermore, the phenotypes observed in Pref-1-null mice are present in heterozygotes that harbor a paternally inherited, but not in those with a maternally inherited pref-1-null allele.Our results demonstrate that Pref-1 is indeed paternally expressed and is important for normal development and for homeostasis of adipose tissue mass.We also suggest that Pref-1 is responsible for most of the symptoms observed in mouse mUPD12 and human mUPD14.Pref-1-null mice may be a model for obesity and other pathologies of human mUPD14.

The role of AMP-activated protein kinase (AMPK) in promoting fatty acid (FA) oxidation in various tissues, such as liver and muscle, has been well understood. However, the role of AMPK in lipolysis and FA metabolism in adipose tissue has been controversial. To investigate the role of AMPK in the regulation of adipose lipolysis in vivo, we generated mice with adipose-tissue-specific knockout of both the α1 and α2 catalytic subunits of AMPK (AMPK-ASKO mice) by using aP2-Cre and adiponectin-Cre. Both models of AMPK-ASKO ablation show no changes in desnutrin/ATGL levels but have defective phosphorylation of desnutrin/ATGL at S406 to decrease its triacylglycerol (TAG) hydrolase activity, lowering basal lipolysis in adipose tissue. These mice also show defective phosphorylation of hormone-sensitive lipase (HSL) at S565, with higher phosphorylation at protein kinase A sites S563 and S660, increasing its hydrolase activity and isoproterenol-stimulated lipolysis. With higher overall adipose lipolysis, both models of AMPK-ASKO mice are lean, having smaller adipocytes with lower TAG and higher intracellular free-FA levels. Moreover, FAs from higher lipolysis activate peroxisome proliferator-activated receptor delta to induce FA oxidative genes and increase FA oxidation and energy expenditure. Overall, for the first time, we provide in vivo evidence of the role of AMPK in the phosphorylation and regulation of desnutrin/ATGL and HSL and thus adipose lipolysis.

ABSTRACT Kings and queens of eusocial termites can live for decades, while queens sustain a nearly maximal fertility. To investigate the molecular mechanisms underlying their long lifespan, we carried out transcriptomics, lipidomics and metabolomics in Macrotermes natalensis on sterile short-lived workers, long-lived kings and five stages spanning twenty years of adult queen maturation. Reproductives share gene expression differences from workers in agreement with a reduction of several aging-related processes, involving upregulation of DNA damage repair and mitochondrial functions. Anti-oxidant gene expression is downregulated, while peroxidability of membranes in queens decreases. Against expectations, we observed an upregulated gene expression in fat bodies of reproductives of several components of the IIS pathway, including an insulin-like peptide, Ilp9. This pattern does not lead to deleterious fat storage in physogastric queens, while simple sugars dominate in their hemolymph and large amounts of resources are allocated towards oogenesis. Our findings support the notion that all processes causing aging need to be addressed simultaneously in order to prevent it.

ABSTRACT ApoL6 is a new LD-associated protein containing an apoprotein-like domain, expressed mainly in adipose tissue, specifically in adipocytes. ApoL6 expression is low in fasting but induced upon feeding. ApoL6 knockdown results in smaller LD with lower triglyceride (TAG) content in adipocytes, while ApoL6 overexpression causes larger LD with higher TAG content. We show that ApoL6 effect in adipocytes is by inhibition of lipolysis. While ApoL6, Perilipin 1 (Plin1) and HSL can form a complex on LD, C-terminal domain of ApoL6 directly interacts with Plin1, to compete with Plin1 binding to HSL through Plin1 N-terminal domain, thereby keeping HSL in a “stand by” status. Thus, ApoL6 ablation decreases WAT mass, protecting mice from diet-induced obesity, while adipose overexpression increases WAT mass to bring obesity and insulin resistance with hepatosteatosis, making ApoL6 a potential future target against obesity and diabetes.