Abstract The ATPase Family, AAA domain-containing protein 2 (ATAD2) bromodomain (BRD) has a canonical bromodomain structure consisting of four α-helices. ATAD2 functions as a co-activator of the androgen and estrogen receptors as well as the MYC and E2F transcription factors. ATAD2 also functions during DNA replication, recognizing newly synthesized histones. In addition, ATAD2 is shown to be up regulated in multiple forms of cancer including breast, lung, gastric, endometrial, renal, and prostate. Furthermore, up-regulation of ATAD2 is strongly correlated with poor prognosis in many types of cancer, making the ATAD2 bromodomain an innovative target for cancer therapeutics. In this study, we describe the recognition of histone acetyllysine modifications by the ATAD2 bromodomain. Residue-specific information on the complex formed between the histone tail and the ATAD2 bromodomain, obtained through nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and X-ray crystallography, illustrates key residues lining the binding pocket, which are involved in coordination of di-acetylated histone tails. Analytical ultracentrifugation, NMR relaxation data, and isothermal titration calorimetry further confirm the monomeric state of the functionally active ATAD2 bromodomain in complex with di-acetylated histone ligands. Overall, we describe histone tail recognition by ATAD2 BRD and illustrate that one acetyllysine group is primarily engaged by the conserved asparagine (N1064), the “RVF” shelf residues, and the flexible ZA loop. Coordination of a second acetyllysine group also occurs within the same binding pocket, but is essentially governed by unique hydrophobic and electrostatic interactions making the di-acetyllysine histone coordination more specific than previously presumed.

ABSTRACT The ATPase family AAA+ domain containing 2 (ATAD2) protein, and its paralog ATAD2B, have a C-terminal bromodomain that functions as a ‘reader’ of acetylated lysine residues on histone proteins. Using a structure-function approach, we investigated the ability of the ATAD2 and ATAD2B bromodomains to select acetylated lysine among multiple histone post-translational modifications. Isothermal titration calorimetry experiments revealed that the ATAD2 and ATAD2B bromodomains selectively recognize distinct patterns of acetylated lysine residues on the N-terminal tails of histone proteins. Adjacent methylation or phosphorylation marks were found to either enhance or weaken the recognition of acetylated lysine by the ATAD2/B bromodomains. Complementary structural studies provide mechanistic insights into how residues within the bromodomain binding pocket coordinate the acetyllysine group in the context of adjacent post- translational modifications. Furthermore, we investigated how sequence changes in amino acids of the histone ligands, either as ‘onco’ mutations or as histone variants, impact the recognition of an adjacent acetylated lysine residue. In summary, our study highlights how the interplay between multiple combinations of histone modifications influences the ‘reader’ activity of the ATAD2 and ATAD2B bromodomains, resulting in distinct binding modes of the two bromodomains. KEY POINTS Multiple independent ATAD2 gene duplication events are evident during metazoan evolution, indicating expansion of functionality in the ATAD2 gene family and suggesting distinct functions for ATAD2 and ATAD2B. High-resolution structures of the ATAD2 and ATAD2B bromodomains in complex with their histone ligands demonstrate how multiple post-translational modifications are coordinated. Recognition of different subsets acetylated histone ligands by the ATAD2 and ATAD2B bromodomains is driven by unique features within the binding pockets of these paralogous proteins. Onco-histone mutations and histone variants that change the amino acid sequence of the histone tails modulate the ATAD2 and ATAD2B bromodomain activity. This study demonstrates how the combinatorial activity of multiple post- translational modifications forms a histone code and influences the recognition of acetylated lysine by bromodomain-containing proteins.

ABSTRACT Plasmodium falciparum requires a two-host system, moving between Anopheles mosquito and humans, to complete its life cycle. To overcome such dynamic growth conditions its histones undergo various post-translational modifications to up-regulate and down-regulate certain genes required for invasion and replication. The P. falciparum genome encodes six bromodomaincontaining proteins, of which Bromodomain Protein 1 (PfBDP1) has been shown to interact with acetylated lysine modifications on histone H3 to regulate the expression of invasion-related genes. Here, we investigated the ability of the PfBDP1 bromodomain to interact with acetyllsyine modifications on additional core and variant histones. A crystal structure of the PfBDP1 bromodomain (PfBDP1-BRD) reveals it contains the conserved bromodomain fold, but our comparative analysis between the PfBDP1-BRD and the 8 human bromodomain families indicates it has a unique binding mechanism. Solution NMR spectroscopy and ITC binding assays carried out with acetylated histone ligands demonstrate that it preferentially recognizes tetra-acetylated histone H4, and we detected weaker interactions with multi-acetylated H2A.Z in addition to the previously reported interactions with acetylated histone H3. Our findings indicate PfBDP1 may play additional roles in the P. falciparum life cycle, and the distinctive features of its bromodomain binding pocket could be leveraged for the development of new therapeutic agents to help overcome the continuously evolving resistance of P. falciparum against currently available drugs.