Integrin-mediated leukocyte adhesion is a critical aspect of leukocyte function that is tightly regulated by diverse stimuli, including chemokines, antigen receptors, and adhesion receptors. How cellular signals from CD31 and other adhesion amplifiers are integrated with those from classical mitogenic stimuli to regulate leukocyte function remains poorly understood. Here, we show that the cytoplasmic tail of CD31, an important integrin adhesion amplifier, propagates signals that induce T cell adhesion via β1 (VLA-4) and β2 (LFA-1) integrins. We identify the small GTPase, Rap1, as a critical mediator of this effect. Importantly, CD31 selectively activated the small Ras-related GTPase, Rap1, but not Ras, R-Ras, or Rap2. An activated Rap1 mutant stimulated T lymphocyte adhesion to intercellular adhesion molecule (ICAM) and vascular cell adhesion molecule (VCAM), as did the Rap1 guanine nucleotide exchange factor C3G and a catalytically inactive mutant of RapGAP. Conversely, negative regulators of Rap1 signaling blocked CD31-dependent adhesion. These findings identify a novel important role for Rap1 in regulating ligand-induced cell adhesion and suggest that Rap1 may play a more general role in coordinating adhesion-dependent signals during leukocyte migration and extravasation. Our findings also suggest an alternative mechanism, distinct from interference with Ras-proximal signaling, by which Rap1 might mediate transformation reversion.

Transcription-coupled DNA repair (TCR) removes bulky DNA lesions impeding RNA polymerase II (RNAPII) transcription. Recent studies have outlined the stepwise assembly of TCR factors CSB, CSA, UVSSA, and TFIIH around lesion-stalled RNAPII. However, the mechanism and factors required for the transition to downstream repair steps, including RNAPII removal to provide repair proteins access to the DNA lesion, remain unclear. Here, we identify STK19 as a new TCR factor facilitating this transition. Loss of STK19 does not impact initial TCR complex assembly or RNAPII ubiquitylation but delays lesion-stalled RNAPII clearance, thereby interfering with the downstream repair reaction. Cryo-EM and mutational analysis reveal that STK19 associates with the TCR complex, positioning itself between RNAPII, UVSSA, and CSA. The structural insights and molecular modeling suggest that STK19 positions the ATPase subunits of TFIIH onto DNA in front of RNAPII. Together, these findings provide new insights into the factors and mechanisms required for TCR.

ABSTRACT The cohesin complex regulates higher order chromosome architecture through maintaining sister chromatid cohesion and folding chromatin by active DNA loop extrusion. Impaired cohesin function underlies a heterogeneous group of genetic syndromes and is associated with cancer. Here, by using synthetic lethality CRISPR screens in isogenic human cell lines defective of specific cohesion regulators, we mapped the genetic dependencies induced by absence of DDX11 or ESCO2. The obtained high confidence synthetic lethality networks are strongly enriched for genes involved in DNA replication and mitosis and support the existence of parallel sister chromatid cohesion establishment pathways. Among the hits, we identified the chromatin binding, BRCT-domain containing protein PAXIP1 as a novel cohesin regulator. Depletion of PAXIP1 severely aggravated cohesion defects in ESCO2 defective cells, leading to mitotic cell death. PAXIP1 promoted the global chromatin association of cohesin, independent of DNA replication, a function that could not be explained by indirect effects of PAXIP1 on transcription or the DNA damage response. Cohesin regulation by PAXIP1 required its binding partner PAGR1 and a conserved FDF motif in PAGR1. Similar motifs were previously found in multiple cohesin regulators, including CTCF, to mediate physical interactions with cohesin. PAXIP1 co-localizes with cohesin on multiple genomic loci, including at active gene promoters and enhancers. Together, this study identifies the PAXIP1-PAGR1 complex as a novel regulator of cohesin occupancy on chromatin. Possibly, this role in cohesin regulation is also relevant for previously described functions of PAXIP1 in transcription, immune cell maturation and DNA repair.

Abstract CRISPR screens provide large-scale assessment of cellular gene functions. Pooled libraries typically consist of several single guide RNAs (sgRNAs) per gene, for a large number of genes, which are transduced in such a way that every cell receives at most one sgRNA, resulting in the disruption of a single gene in that cell. This approach is often used to investigate effects on cellular fitness, by measuring sgRNA abundance at different time points. Comparing gene knockout effects between different cell populations is challenging due to variable cell-type specific parameters and between replicates variation. Failure to take those into account can lead to inflated or false discoveries. We propose a new, flexible approach called ShrinkCRISPR that can take into account multiple sources of variation. Impact on cellular fitness between conditions is inferred by using a mixed-effects model, which allows to test for gene-knockout effects while taking into account sgRNA-specific variation. Estimates are obtained using an empirical Bayesian approach. ShrinkCRISPR can be applied to a variety of experimental designs, including multiple factors. In simulation studies, we compared ShrinkCRISPR results with those of drugZ and MAGeCK, common methods used to detect differential effect on cell fitness. ShrinkCRISPR yielded as many true discoveries as drugZ using a paired screen design, and outperformed both drugZ and MAGeCK for an independent screen design. Although conservative, ShrinkCRISPR was the only approach that kept false discoveries under control at the desired level, for both designs. Using data from several publicly available screens, we showed that ShrinkCRISPR can take data for several time points into account simultaneously, helping to detect early and late differential effects. ShrinkCRISPR is a robust and flexible approach, able to incorporate different sources of variations and to test for differential effect on cell fitness at the gene level. These improve power to find effects on cell fitness, while keeping multiple testing under the correct control level and helping to improve reproducibility. ShrinkCrispr can be applied to different study designs and incorporate multiple time points, making it a complete and reliable tool to analyze CRISPR screen data.

Abstract Germline inactivating mutations in folliculin (FLCN) cause Birt–Hogg–Dubé (BHD) syndrome, a rare autosomal dominant disorder predisposing to kidney tumors. Kidney tumors associated with BHD typically lack FLCN expression due to loss of heterozygosity. In this study we assessed the potential of four commercial anti-FLCN antibodies for immunohistochemistry, as currently no routine diagnostic FLCN stainings are performed in the clinic. Despite comprehensive testing, we could not identify a commercial anti-FLCN antibody that is reproducibly effective in immunohistochemical analyses of formalin-fixed paraffin-embedded tissue material. We propose that dedicated future efforts are required to develop a suitable antibody for diagnostic immunohistochemical stainings. The inclusion of FLCN expression status as part of standard renal tumor pathology may contribute to better analyses of the molecular pathology of BHD tumors and facilitate identification of BHD patients, improve their (genetic and clinical) counseling, and enable genetic testing of at risk relatives.

Summary Cells employ transcription-coupled repair (TCR) to eliminate transcription-blocking DNA lesions. The binding of the TCR-specific repair factor CSB triggers DNA damage-induced ubiquitylation of RNA polymerase II (RNAPII) at a single lysine (K1268) by the CRL4 CSA ubiquitin ligase. However, how the CRL4 CSA ligase is specifically directed toward the K1268 site is unknown. Here, we identify ELOF1 as the missing link that facilitates RNAPII ubiquitylation, a key signal for the assembly of downstream repair factors. This function requires its constitutive interaction with RNAPII close to the K1268 site, revealing ELOF1 as a specificity factor that positions CRL4 CSA for optimal RNAPII ubiquitylation. Furthermore, drug-genetic interaction screening reveals an unanticipated compensatory TCR pathway in which ELOF1 together with known factors DOT1L and HIRA protect CSB-deficient cells from collisions between transcription and replication machineries. Our study provides a genetic framework of the transcription stress response and reveals key insights into the molecular mechanism of TCR.

In a process linked to DNA replication, duplicated chromosomes are co-entrapped into large, circular cohesin complexes and functional sister chromatid cohesion (SCC) is established by acetylation of the SMC3 cohesin subunit. Several rare human developmental syndromes are characterized by defective SCC. Roberts Syndrome (RBS) is caused by mutations in the SMC3 acetyl transferase ESCO2, whereas mutations in the DNA helicase DDX11 lead to Warsaw Breakage Syndrome (WABS). We found that WABS-derived cells predominantly rely on ESCO2, not ESCO1, for residual SCC, growth and survival. Reciprocally, RBS-derived cells depend on DDX11 to maintain low levels of SCC. Synthetic lethality between DDX11 and ESCO2 correlated with a prolonged delay in mitosis, and was rescued by knock down of the cohesion remover WAPL. Rescue experiments using mouse or human cDNAs revealed that DDX11, ESCO1 and ESCO2 act on differential aspects of DNA replication-coupled SCC establishment. Importantly, DDX11 is required for normal DNA replication fork speed without clearly affecting SMC3 acetylation. We propose that DDX11 and ESCO2 control spatially separated fractions of cohesin, with supportive roles for DDX11 in replication-associated cohesion establishment, and for ESCO2 in cohesin complexes located around centromeres, respectively.

BHD-associated renal tumors are considered to be of indolent behavior and therefore, treatment of renal tumors can be postponed until the tumor reaches a diameter of 3 cm (3 cm rule) [6,7]. Case descriptionA 53 year old women presented with acute back pain.Ultrasound examination showed a right-sided renal mass measuring 2.5 × 1.5 × 2 cm.On CT, the tumor had a maximal diameter of 2.8 cm (indicated by the arrow in Fig. 1).She was initially treated by partial nephrectomy.Histological evaluation showed a 2.8 cm eosinophilic chromophobe RCC, Fuhrmann grade 2, positive for cytokeratin 7, 8 and 18, EMA, CD10, and colloidal iron and negative for vimentin.As not all resection margins were free of tumor, a radical nephrectomy was performed subsequently.No residual tumor was detected in the remaining kidney tissue.Follow-up took place according to appropriate guidelines for RCC.At age 59, six years after removal of the primary tumor, six omental metastases were identified on abdominal CT.A biopsy showed a malignancy, histologically comparable to the previously removed primary tumor (PAX8, CK7, CD117 and CD10 positive).Since the patient had no lesions in her remaining kidney, the omental lesions were considered metastases from the primary tumor diagnosed 6 years previously.Molecular testing to get extra evidence for clonality between the primary tumor and the metastases was not possible, as no suitable material of the primary tumor was available.After diagnosis of the omental metastases, the patient was treated with immunotherapy in a phase II study (4 cycles nivolumab and iplimumab followed by 14 cycles nivolumab).The metastases show minimal progression

ABSTRACT With the recent rise in CRISPR/Cas9-mediated genome-wide synthetic lethality screens, many new synthetic lethal targets have been identified for diseases with underlying genetic causes such as tumours with BRCA1 mutations. Such screens often use full deficiency of a protein to identify novel vulnerabilities. However, patient-derived mutations not only result in loss of the protein but often also concern missense mutations with hypomorphic phenotypes. Here we study the genetic vulnerabilities of two previously described hypomorphic BRCA1 missense mutations and compare these to a BRCA1-depleted setting to study whether this affects screening for synthetic lethal interactions. Our research showed that BRCA1 I26A mutated cells have very similar vulnerabilities to BRCA1 wildtype cells, confirming its low tumorigenic effect. In contrast, the BRCA1 R1699Q mutation induced a more similar phenotype to BRCA1-deficient cells. For this mutation, we also unveiled a unique vulnerability to the loss of NDE1. Specifically in BRCA1 R1699Q mutated cells, and not BRCA1-proficient or -deficient cells, NDE1 loss leads to increased genomic instability. Altogether our findings highlight the importance to differentiate between patient-derived mutations when assessing novel treatment targets.