Abstract Methanogenesis allows methanogenic archaea (methanogens) to generate cellular energy for their growth while producing methane. Hydrogenotrophic methanogens thrive on carbon dioxide and molecular hydrogen as sole carbon and energy sources. Thermophilic and hydrogenotrophic Methanothermobacter spp. have been recognized as robust biocatalysts for a circular carbon economy and are now applied in power-to-gas technology. Here, we generated the first manually curated genome-scale metabolic reconstruction for three Methanothermobacter spp‥ We investigated differences in the growth performance of three wild-type strains and one genetically engineered strain in two independent chemostat bioreactor experiments. In the first experiment, with molecular hydrogen and carbon dioxide, we found the highest methane production rate for Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH, while Methanothermobacter marburgensis Marburg reached the highest biomass growth rate. Systems biology investigations, including implementing a pan-model that contains combined reactions from all three microbes, allowed us to perform an interspecies comparison. This comparison enabled us to identify crucial differences in formate anabolism. In the second experiment, with sodium formate, we found stable growth with an M. thermautotrophicus ΔH plasmid-carrying strain with similar performance parameters compared to wild-type Methanothermobacter thermautotrophicus Z-245. Our findings reveal that formate anabolism influences the diversion of carbon to biomass and methane with implications for biotechnological applications of Methanothermobacter spp. in power-to-gas technology and for chemical production. Graphical Abstract Broader context Renewable energy sources (e.g., wind and solar) provide carbon-free electric power. However, their intermittency and offset between peak production and demand generate the need to store this electric power. Furthermore, these technologies alone do not satisfy the demand for carbon-based commodities. Power-to-gas technology provides a means to store intermittent renewable electric power with concomitant carbon dioxide recycling into a chemical energy carrier, such as methane, on a centralized and decentralized scale. This is particularly important to establish equitable energy strategies for all countries, as is highlighted by the United Nations Sustainable Development Goals. With this work, we provide an integrated systems-biology platform for Methanothermobacter spp. to optimize biological power-to-gas technology and formulate strategies to produce other value-added products besides methane.

Acetogenic bacteria can convert waste gases into fuels and chemicals. Design of bioprocesses for waste carbon valorization requires quantification of steady-state carbon flows. Here, steady-state quantification of autotrophic chemostats containing Clostridium autoethanogenum grown on CO2 and H2 revealed that captured carbon (460 ± 80 mmol/gDCW/day) had a significant distribution to ethanol (54 ± 3 mol% with a 2.4 ± 0.3 g/L titer). We were impressed with this initial result, but also observed limitations to biomass concentration and growth rate. Metabolic modelling predicted culture performance and indicated significant metabolic adjustments when compared to fermentation with CO as the carbon source. Moreover, modelling highlighted flux to pyruvate, and subsequently reduced ferredoxin, as a target for improving CO2 and H2 fermentation. Supplementation with a small amount of CO enabled co-utilisation with CO2, and enhanced CO2 fermentation performance significantly, while maintaining an industrially relevant product profile. Additionally, the highest specific flux through the Wood-Ljungdahl pathway was observed during co-utilization of CO2 and CO. Furthermore, the addition of CO led to superior CO2-valorizing characteristics (9.7 ± 0.4 g/L ethanol with a 66 ± 2 mol% distribution, and 540 ± 20 mmol CO2/gDCW/day). Similar industrial processes are commercial or currently being scaled up, indicating CO-supplemented CO2 and H2 fermentation has high potential for sustainable fuel and chemical production. This work also provides a reference dataset to advance our understanding of CO2 gas fermentation, which can contribute to mitigating climate change.

Acetogenic bacteria are rising in popularity as chassis microbes in biotechnology due to their capability of converting inorganic one-carbon (C1) gases to organic chemicals. To fully uncover the potential of acetogenic bacteria, synthetic-biology tools are imperative to either engineer designed functions or to interrogate the physiology. Here, we report a genome-editing tool at a one-nucleotide resolution, namely base editing, for acetogenic bacteria based on CRISPR-targeted deamination. This tool combines nuclease deactivated Cas9 with activation-induced cytidine deaminase to enable cytosine-to-thymine substitution without DNA cleavage, homology-directed repair, and donor DNA, which are generally the bottlenecks for applying conventional CRISPR-Cas systems in bacteria. We designed and validated a modularized base-editing tool in the model acetogenic bacterium Clostridium ljungdahlii. The editing principles were investigated, and an in-silico analysis revealed the capability of base editing across the genome. Moreover, genes related to acetate and ethanol production were disrupted individually by installing premature STOP codons to reprogram carbon flux towards improved acetate production. This resulted in engineered C. ljungdahlii strains with the desired phenotypes and stable genotypes. Our base-editing tool promotes the application and research in acetogenic bacteria and provides a blueprint to upgrade CRISPR-Cas-based genome editing in bacteria in general.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.