Despite remarkable success in the treatment of hematological malignancies, CAR T-cell therapies for solid tumors have floundered, in large part due to local immune suppression and the effects of prolonged stimulation leading to T-cell dysfunction and exhaustion. One mechanism by which gliomas and other cancers can hamper CAR T cells is through surface expression of inhibitory ligands such as programmed cell death ligand 1 (PD-L1). Using the CRIPSR-Cas9 system, we created universal CAR T cells resistant to PD-1 inhibition through multiplexed gene disruption of endogenous T-cell receptor (TRAC), beta-2 microglobulin (B2M) and PD-1 (PDCD1). Triple gene-edited CAR T cells demonstrated enhanced activity in preclinical glioma models. Prolonged survival in mice bearing intracranial tumors was achieved after intracerebral, but not intravenous administration. CRISPR-Cas9 gene-editing not only provides a potential source of allogeneic, universal donor cells, but also enables simultaneous disruption of checkpoint signaling that otherwise impedes maximal antitumor functionality.

Abstract Chimeric antigen receptor (CAR) T cells induce impressive responses in patients with hematologic malignancies but can also trigger cytokine release syndrome (CRS), a systemic toxicity caused by activated CAR T cells and innate immune cells. Although IFNγ production serves as a potency assay for CAR T cells, its biologic role in conferring responses in hematologic malignancies is not established. Here we show that pharmacologic blockade or genetic knockout of IFNγ reduced immune checkpoint protein expression with no detrimental effect on antitumor efficacy against hematologic malignancies in vitro or in vivo. Furthermore, IFNγ blockade reduced macrophage activation to a greater extent than currently used cytokine antagonists in immune cells from healthy donors and serum from patients with CAR T-cell–treated lymphoma who developed CRS. Collectively, these data show that IFNγ is not required for CAR T-cell efficacy against hematologic malignancies, and blocking IFNγ could simultaneously mitigate cytokine-related toxicities while preserving persistence and antitumor efficacy. Significance: Blocking IFNγ in CAR T cells does not impair their cytotoxicity against hematologic tumor cells and paradoxically enhances their proliferation and reduces macrophage-mediated cytokines and chemokines associated with CRS. These findings suggest that IFNγ blockade may improve CAR T-cell function while reducing treatment-related toxicity in hematologic malignancies. See interview with Stefanie R. Bailey, PhD, recipient of the 2023 Blood Cancer Discovery Award for Outstanding Journal Article: https://vimeo.com/847433865 See related content by McNerney et al., p. 90 (17). This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 85

Approximately 50% of patients with hematologic malignancies relapse after chimeric antigen receptor (CAR) T cell treatment; mechanisms of failure include loss of CAR T persistence and tumor resistance to apoptosis. We hypothesized that both of these challenges could potentially be overcome by overexpressing one or more of the Bcl-2 family proteins in CAR T cells to reduce their susceptibility to apoptosis, both alone and in the presence of BH3 mimetics, which can be used to activate apoptotic machinery in malignant cells. We comprehensively investigated overexpression of different Bcl-2 family proteins in CAR T cells with different signaling domains as well as in different tumor types. We found that Bcl-xL and Bcl-2 overexpression in CAR T cells bearing a 4-1BB costimulatory domain resulted in increased expansion and antitumor activity, reduced exhaustion, and decreased apoptotic priming. In addition, CAR T cells expressing either Bcl-xL or a venetoclax-resistant Bcl-2 variant led to enhanced antitumor efficacy and survival in murine xenograft models of lymphoma and leukemia in the presence or absence of the BH3 mimetic venetoclax, a clinically approved BH3 mimetic. In this setting, Bcl-xL overexpression had stronger effects than overexpression of Bcl-2 or the Bcl-2(G101V) variant. These findings suggest that CAR T cells could be optimally engineered by overexpressing Bcl-xL to enhance their persistence while opening a therapeutic window for combination with BH3 mimetics to prime tumors for apoptosis.

SUMMARY Phosphatidylinositol-3-kinase p110δ (PI3Kδ) inhibition by Idelalisib (CAL-101) in hematological malignancies directly induces apoptosis in cancer cells and disrupts immunological tolerance by depleting regulatory T cells (Tregs). Yet, little is known about the direct impact of PI3Kδ blockade on effector T cells from CAL-101 therapy. Herein, we demonstrate a direct effect of p110δ inactivation via CAL-101 on murine and human CD8 + T cells that promotes a strong undifferentiated memory phenotype (elevated CD62L/CCR7, CD127 and Tcf7). These CAL-101 T cells also persisted longer after transfer and exerted stronger antitumor immunity compared to traditionally expanded CD8 + T cells in two solid tumor models. Thus, this report describes a novel direct enhancement of CD8 + T cell memory by a p110δ inhibitor that leads to markedly improved tumor regression. This finding has significant implications to improve outcomes from next generation cancer immunotherapies. Highlights In vitro blockade of PI3K p110δ with CAL-101 endows antitumor T cells with a stronger memory phenotype than those treated with AKTi The strong memory phenotype of CAL-101 treated cells translates into improved survival of mice bearing aggressive tumors after adoptive transfer of these T cells Human CAR engineered T cells treated with CAL-101 possess an enhanced memory phenotype and robust antitumor efficacy The antitumor efficacy of CAL-101 primed T cells is not mediated by high CD62L or CD127 expression, but is likely driven by their stem memory phenotype eTOC Blurb Bowers et al report a novel function of PI3K blockade using the p110δ subunit inhibitor CAL-101 to induce memory and antitumor potency in CD8 + T cells. Ex vivo treatment of T cells with CAL-101 leads to improved antitumor control and subject survival in both murine transgenic T cell and human CAR T cell models.

How naturally arising human CD4+ T helper subsets impact tumor immunity is unknown. We reported that human CD4+CD26high T cells elicit potent immunity against solid tumor malignancies. As CD26high T cells secrete type-17 cytokines and have been categorized as Th17 cells, we posited these helper populations would possess similar molecular properties. Herein, we reveal that CD26high T cells are epigenetically and transcriptionally distinct from Th17 cells. Of clinical significance, CD26high T cells engineered with a chimeric antigen receptor (CAR) ablated large human tumors to a greater extent than enriched Th17, Th1, or Th2 cells. Moreover, CD26high T cells mediated curative responses in mice, even when redirected with a suboptimal CAR and without the aid of CD8+ CAR T cells. CD26high T cells co-secreted effector cytokines at heightened levels and robustly persisted. Collectively, our work reveals the potential of human CD4+ T cell populations to improve durability of solid tumor therapies.