We present OSPREY 3.0, a new and greatly improved release of the OSPREY protein design software. OSPREY 3.0 features a convenient new Python interface, which greatly improves its ease of use. It is over two orders of magnitude faster than previous versions of OSPREY when running the same algorithms on the same hardware. Moreover, OSPREY 3.0 includes several new algorithms, which introduce substantial speedups as well as improved biophysical modeling. It also includes GPU support, which provides an additional speedup of over an order of magnitude. Like previous versions of OSPREY, OSPREY 3.0 offers a unique package of advantages over other design software, including provable design algorithms that account for continuous flexibility during design and model conformational entropy. Finally, we show here empirically that OSPREY 3.0 accurately predicts the effect of mutations on protein-protein binding. OSPREY 3.0 is available at http://www.cs.duke.edu/donaldlab/osprey.php as free and open-source software.

The K* algorithm provably approximates partition functions for a set of states (e.g., protein, ligand, and protein-ligand complex) to a user-specified accuracy ϵ.Often, reaching an ϵ -approximation for a particular set of partition functions takes a prohibitive amount of time and space. To alleviate some of this cost, we introduce two algorithms into the OSPREY suite for protein design: FRIES, a Fast Removal of Inadequately Energied Sequences, and EWAK*, an Energy Window Approximation to K*. In combination, these algorithms provably retain calculational accuracy while limiting the input sequence space and the conformations included in each partition function calculation to only the most energetically favorable. This combined approach leads to significant speed-ups compared to the previous state-of-the-art multi-sequence algorithm, BBK*. As a proof of concept, we used these new algorithms to redesign the protein-protein interface (PPI) of the c-Raf-RBD:KRas complex. The Ras-binding domain of the protein kinase c-Raf (c-Raf-RBD) is the tightest known binder of KRas, a historically “undruggable” protein implicated in difficult-to-treat cancers including pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). FRIES/EWAK* accurately retrospectively predicted the effect of 38 out of 41 different sets of mutations in the PPI of the c-Raf-RBD:KRas complex. Notably, these mutations include mutations whose effect had previously been incorrectly predicted using other computational methods. Next, we used FRIES/EWAK* for prospective design and discovered a novel point mutation that improves binding of c-Raf-RBD to KRas in its active, GTP-bound state (KRas GTP ). We combined this new mutation with two previously reported mutations (which were also highly-ranked by OSPREY) to create a new variant of c-Raf-RBD, c-Raf-RBD(RKY). FRIES/EWAK* in OSPREY computationally predicted that this new variant would bind even more tightly than the previous best-binding variant, c-Raf-RBD(RK). We measured the binding affinity of c-Raf-RBD(RKY) using a bio-layer interferometry (BLI) assay and found that this new variant exhibits single-digit nanomolar affinity for KRas GTP , confirming the computational predictions made with FRIES/EWAK*. This study steps through the advancement and development of computational protein design by presenting theory, new algorithms, accurate retrospective designs, new prospective designs, and biochemical validation.

The spread of plasmid borne resistance enzymes in clinical Staphylococcus aureus isolates is rendering trimethoprim and iclaprim, both inhibitors of dihydrofolate reductase (DHFR), ineffective. Continued exploitation of these targets will require compounds that can broadly inhibit these resistance-confering isoforms. Using a structure-based approach, we have developed a novel class of ionized non-classical antifolates (INCAs) that capture the molecular interactions that have been exclusive to classical antifolates. These modifications allow for a greatly expanded spectrum of activity across these pathogenic DHFR isoforms, while maintaining the ability to penetrate the bacterial cell wall. Using biochemical, structural and computational methods, we are able to optimize these inhibitors to the conserved active sites of the endogenous and trimethoprim resistant DHFR enzymes. Here, we report a series of INCA compounds that exhibit low nanomolar enzymatic activity and potent cellular activity with human selectivity against a panel of clinically relevant TMPR MRSA isolates.

Antimicrobial resistance is a health care crisis. The resistance-conferring mutation F98Y in Staphylococcus aureus dihydrofolate reductase (SaDHFR) reduces effectiveness of antifolates, e.g., trimethoprim (TMP). Although propargyl-linked antifolates (PLAs) are much more resilient than TMP towards F98Y, this substitution still vitiates their inhibition potency. Surprisingly, differences in the enantiomeric configuration at the stereogenic center of PLAs influence the isomeric state of NADPH cofactor. Is resistance correlated with chiral evasion? A mechanism of action underpinning this coupling is unknown. To understand the molecular basis of F98Y-mediated resistance and how PLAs’ inhibition drives NADPH isomeric states, we used OSPREY to analyze a comprehensive suite of structural, biophysical, biochemical, and computational data. We present a model showing how F98Y SaDHFR exploits a different anomeric configuration of NADPH to evade certain PLAs’ inhibition, while other PLAs remain resilient to resistance. Our model should enable general design of inhibitors that are resilient to chiral evasion.