PT
Paul Thomas
Author with expertise in Mass Spectrometry Techniques with Proteins
Achievements
Cited Author
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
11
(45% Open Access)
Cited by:
2,314
h-index:
55
/
i10-index:
100
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

How many human proteoforms are there?

Ruedi Aebersold et al.Feb 14, 2018
+50
I
J
R
Despite decades of accumulated knowledge about proteins and their post-translational modifications (PTMs), numerous questions remain regarding their molecular composition and biological function. One of the most fundamental queries is the extent to which the combinations of DNA-, RNA- and PTM-level variations explode the complexity of the human proteome. Here, we outline what we know from current databases and measurement strategies including mass spectrometry-based proteomics. In doing so, we examine prevailing notions about the number of modifications displayed on human proteins and how they combine to generate the protein diversity underlying health and disease. We frame central issues regarding determination of protein-level variation and PTMs, including some paradoxes present in the field today. We use this framework to assess existing data and to ask the question, "How many distinct primary structures of proteins (proteoforms) are created from the 20,300 human genes?" We also explore prospects for improving measurements to better regularize protein-level biology and efficiently associate PTMs to function and phenotype.
0
Citation722
0
Save
0

Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics

John Tran et al.Oct 30, 2011
+15
D
L
J
Conventional 'bottom-up' proteomics, in which mass spectrometry is used to analyse peptide mixtures made by tryptic digestion of target proteins, is a powerful way of characterizing complex proteomes. However, the technique has limitations when considering different protein isoforms and combinations of post-translational modifications. The 'top-down' approach is generally thought to be impractical because of the limitations of mass spectrometry and difficulties with automation. A new top-down system presented here avoids these problems by using a four-dimensional separation system that achieves greater proteome coverage than conventional methods. A proof-of-principle experiment shows that the method is capable of identifying previously undetected isoforms and isoform-specific post-translational modifications caused by cellular senescence. A full description of the human proteome relies on the challenging task of detecting mature and changing forms of protein molecules in the body. Large-scale proteome analysis1 has routinely involved digesting intact proteins followed by inferred protein identification using mass spectrometry2. This ‘bottom-up’ process affords a high number of identifications (not always unique to a single gene). However, complications arise from incomplete or ambiguous2 characterization of alternative splice forms, diverse modifications (for example, acetylation and methylation) and endogenous protein cleavages, especially when combinations of these create complex patterns of intact protein isoforms and species3. ‘Top-down’ interrogation of whole proteins can overcome these problems for individual proteins4,5, but has not been achieved on a proteome scale owing to the lack of intact protein fractionation methods that are well integrated with tandem mass spectrometry. Here we show, using a new four-dimensional separation system, identification of 1,043 gene products from human cells that are dispersed into more than 3,000 protein species created by post-translational modification (PTM), RNA splicing and proteolysis. The overall system produced greater than 20-fold increases in both separation power and proteome coverage, enabling the identification of proteins up to 105 kDa and those with up to 11 transmembrane helices. Many previously undetected isoforms of endogenous human proteins were mapped, including changes in multiply modified species in response to accelerated cellular ageing (senescence) induced by DNA damage. Integrated with the latest version of the Swiss-Prot database6, the data provide precise correlations to individual genes and proof-of-concept for large-scale interrogation of whole protein molecules. The technology promises to improve the link between proteomics data and complex phenotypes in basic biology and disease research7.
0

Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation

Jared Shaw et al.May 22, 2013
+7
D
W
J
The top-down approach to proteomics offers compelling advantages due to the potential to provide complete characterization of protein sequence and post-translational modifications. Here we describe the implementation of 193 nm ultraviolet photodissociation (UVPD) in an Orbitrap mass spectrometer for characterization of intact proteins. Near-complete fragmentation of proteins up to 29 kDa is achieved with UVPD including the unambiguous localization of a single residue mutation and several protein modifications on Pin1 (Q13526), a protein implicated in the development of Alzheimer’s disease and in cancer pathogenesis. The 5 ns, high-energy activation afforded by UVPD exhibits far less precursor ion-charge state dependence than conventional collision- and electron-based dissociation methods.
0

The MMSET histone methyl transferase switches global histone methylation and alters gene expression in t(4;14) multiple myeloma cells

Eva Martínez-García et al.Oct 26, 2010
+10
D
R
E
Abstract The multiple myeloma SET domain (MMSET) protein is overexpressed in multiple myeloma (MM) patients with the translocation t(4;14). Although studies have shown the involvement of MMSET/Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 in development, its mode of action in the pathogenesis of MM is largely unknown. We found that MMSET is a major regulator of chromatin structure and transcription in t(4;14) MM cells. High levels of MMSET correlate with an increase in lysine 36 methylation of histone H3 and a decrease in lysine 27 methylation across the genome, leading to a more open structural state of the chromatin. Loss of MMSET expression alters adhesion properties, suppresses growth, and induces apoptosis in MM cells. Consequently, genes affected by high levels of MMSET are implicated in the p53 pathway, cell cycle regulation, and integrin signaling. Regulation of many of these genes required functional histone methyl-transferase activity of MMSET. These results implicate MMSET as a major epigenetic regulator in t(4;14)+ MM.
0
Citation321
0
Save
0

Loss of BAP1 function leads to EZH2-dependent transformation

Lindsay LaFave et al.Oct 5, 2015
+28
R
W
L
The tumor suppressors BAP1 and ASXL1 interact to form a polycomb deubiquitinase complex that removes monoubiquitin from histone H2A lysine 119 (H2AK119Ub). However, BAP1 and ASXL1 are mutated in distinct cancer types, consistent with independent roles in regulating epigenetic state and malignant transformation. Here we demonstrate that Bap1 loss in mice results in increased trimethylated histone H3 lysine 27 (H3K27me3), elevated enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit (Ezh2) expression, and enhanced repression of polycomb repressive complex 2 (PRC2) targets. These findings contrast with the reduction in H3K27me3 levels seen with Asxl1 loss. Conditional deletion of Bap1 and Ezh2 in vivo abrogates the myeloid progenitor expansion induced by Bap1 loss alone. Loss of BAP1 results in a marked decrease in H4K20 monomethylation (H4K20me1). Consistent with a role for H4K20me1 in the transcriptional regulation of EZH2, expression of SETD8-the H4K20me1 methyltransferase-reduces EZH2 expression and abrogates the proliferation of BAP1-mutant cells. Furthermore, mesothelioma cells that lack BAP1 are sensitive to EZH2 pharmacologic inhibition, suggesting a novel therapeutic approach for BAP1-mutant malignancies.
0
Citation321
0
Save
0

Low coherence interferometry for mid IR precision optics manufacturing

Paul Thomas et al.Jun 7, 2024
+6
D
C
P
We report on an optical, non-contact, thickness measurement system for materials that are opaque at ultraviolet (UV) through near infrared (NIR) wavelengths, such as Germanium and Nano-Composite Optical Ceramics (NCOCs). Measurement options do exist, but they must physically touch the sample or rely on an assumed bulk distribution of material. Additionally, optics are often highly sensitive to contamination and greatly benefit from non-contact metrology. The authors used the Lumetrics Optigauge MIR low coherence interferometry (LCI) system to successfully measure a NCOC. A Silicon (Si) control is used as a reference because it can be measured by both an Optigauge II and the Optigauge MIR-LCI system. In this work, the authors successfully measured and report on materials that are transparent in the mid-infrared (MIR) range. The authors speculate that MIR-LCI will enable wedge, thickness, flatness, and other measurements performed using an Optigauge II system for MIR transparent materials.
0

Analysing protein post-translational modform regions by linear programming

Deepesh Agarwal et al.Oct 30, 2018
+7
B
R
D
Post-translational modifications (PTMs) at multiple sites can collectively influence protein function but the scope of such PTM coding has been challenging to determine. The number of potential combinatorial patterns of PTMs on a single molecule increases exponentially with the number of modification sites and a population of molecules exhibits a distribution of such "modforms". Estimating these "modform distributions" is central to understanding how PTMs influence protein function. Although mass-spectrometry (MS) has made modforms more accessible, we have previously shown that current MS technology cannot recover the modform distribution of heavily modified proteins. However, MS data yield linear equations for modform amounts, which constrain the distribution within a high-dimensional, polyhedral "modform region". Here, we show that linear programming (LP) can efficiently determine a range within which each modform value must lie, thereby approximating the modform region. We use this method on simulated data for mitogen-activated protein kinase 1 with the 7 phosphorylations reported on UniProt, giving a modform region in a 128 dimensional space. The exact dimension of the region is determined by the number of linearly independent equations but its size and shape depend on the data. The average modform range, which is a measure of size, reduces when data from bottom-up (BU) MS, in which proteins are first digested into peptides, is combined with data from top-down (TD) MS, in which whole proteins are analysed. Furthermore, when the modform distribution is structured, as might be expected of real distributions, the modform region for BU and TD combined has a more intricate polyhedral shape and is substantially more constrained than that of a random distribution. These results give the first insights into high-dimensional modform regions and confirm that fast LP methods can be used to analyse them. We discuss the problems of using modform regions with real data, when the actual modform distribution will not be known.
0

A synthetic biology approach to probing nucleosome symmetry

Yuichi Ichikawa et al.Jul 31, 2017
+17
U
Y
Y
The repeating subunit of chromatin, the nucleosome, includes two copies of each of the four core histones, and several recent studies have reported that asymmetrically modified nucleosomes occur at regulatory elements in vivo. To probe the mechanisms by which histone modifications are read out, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, which we validated genetically and biochemically. Comparing the effects of asymmetric histone tail point mutants with those of symmetric double mutants revealed that a single methylated H3K36 per nucleosome was sufficient to silence cryptic transcription in vivo. We also demonstrate the utility of this system for analysis of histone modification crosstalk, using mass spectrometry to separately identify modifications on both H3 molecules within asymmetric nucleosomes. The ability to generate asymmetric nucleosomes in vivo provides a powerful tool to probe the mechanism by which H3 tails are read out by effector proteins in the cell.
0

Extending Chemical Perturbations Of The Ubiquitin Fitness Landscape In A Classroom Setting

David Mavor et al.May 17, 2017
+66
E
L
D
Although the primary protein sequence of ubiquitin (Ub) is extremely stable over evolutionary time, it is highly tolerant to mutation during selection experiments performed in the laboratory. We have proposed that this discrepancy results from the difference between fitness under laboratory culture conditions and the selective pressures in changing environments over evolutionary time scales. Building on our previous work (Mavor et al. 2016), we used deep mutational scanning to determine how twelve new chemicals reveal novel mutational sensitivities of ubiquitin residues. We found sensitization of Lys63 in eight new conditions. In total, our experiments have uncovered a highly sensitizing condition for every position in Ub except Ser57 and Gln62. By determining the Ubiquitin fitness landscape under different chemical constraints, our work helps to resolve the inconsistencies between deep mutational scanning experiments and sequence conservation over evolutionary timescales.
0

USP7 cooperates with NOTCH1 to drive the oncogenic transcriptional program in T cell leukemia

Kelly Arcipowski et al.Jan 16, 2018
+46
M
B
K
T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive disease, affecting children and adults. Treatments show high response rates but have debilitating effects and carry risk of relapse. Previous work implicated NOTCH1 and other oncogenes. However, direct inhibition of these pathways affects healthy tissues and cancer alike. Here, we demonstrate that ubiquitin-specific protease 7 (USP7) controls leukemia growth by stabilizing the levels of the NOTCH1 and JMJD3 demethylase. USP7 is overexpressed T-ALL and is transcriptionally regulated by NOTCH1. In turn, USP7 controls NOTCH1 through deubiquitination. USP7 is bound to oncogenic targets and controls gene expression through H2B ubiquitination and H3K27me3 changes via stabilization of NOTCH1 and JMJD3. We also show that USP7 and NOTCH1 bind T-ALL superenhancers, and USP7 inhibition alters associated gene activity. These results provide a new model for deubiquitinase activity through recruitment to oncogenic chromatin loci and regulation of both oncogenic transcription factors and chromatin marks to promote leukemia. USP7 inhibition significantly blocked T-ALL cell growth in vitro and in vivo. Our studies also show that USP7 is upregulated in the aggressive high-risk cases of T-ALL and suggest that USP7 expression might be a prognostic marker in ALL and its inhibition could be a therapeutic tool against aggressive leukemia.
Load More