An organism's ability to respond effectively to environmental change is critical to their survival. Yet, life stage and overall condition can dictate tolerance thresholds to heightened environmental stressors, such that stress may not be equally felt across individuals within a species. Environmental changes can induce transcriptional responses in an organism, some of which reflect generalized responses, and others are highly specific to the type of change being experienced. Thus, if transcriptional biomarkers specific to a heightened environmental stressor, even under multi-stressor impacts, can be identified, the biomarkers could be then applied in natural environments to determine when and where individuals are experiencing such stressors. Here, we validate candidate gill gene expression biomarkers by experimentally challenging juvenile Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). A sophisticated experimental set-up (four trials) manipulated salinity (freshwater, brackish water, and seawater), temperature (10, 14, and 18°C), and dissolved oxygen (normoxia and hypoxia), in all 18 possible combinations, for up to six days during the pre-smolt, smolt, and de-smolt life stages. In addition, we also describe the changes in juvenile behaviour, plasma variables, gill Na+/K+-ATPase (NKA) activity, body size, body morphology, and skin pigmentation associated with salinity, temperature, dissolved oxygen, mortality, and smolt status. We statistically identified biomarkers specific to salinity and temperature treatments, as well as mortality across multiple stressors and life stages. Similar biomarkers for the dissolved oxygen treatment could not be identified in the data and we discuss our next steps using an RNA-seq study. This work demonstrates the unique power of gene expression biomarkers to identify a specific stressor even under multi-stressor conditions.

Aquatic species are increasingly confronted with environmental stressors because of climate change. Although molecular technologies have advanced our understanding of how organisms respond to stressors in laboratory settings, the ability to detect physiological responses to specific stressors under complex field conditions remains underdeveloped. This research applied multi-stressor challenge trials on coho salmon, employing the "Salmon Fit-Chips" genomic tool and a random forest-based classification model to develop classifiers predictive for chronic thermal and hypoxic stress, as well as salinity acclimation, smolt stage and morbidity status. The study also examined how smolts and de-smolts (smolts not having entered SW during the smolt window) responded transcriptionally to exposure to saltwater. Using RF classifiers optimized with 4 to 12 biomarkers, we identified transcriptional signatures that accurately predicted the presence of each stressor and physiological state, achieving prediction accuracy rates between 86.8 % and 100 %, regardless of other background stressors present. Stressor recovery time was established by placing fish back into non-stressor conditions after stress exposure, providing important context to stressor detections in field applications. Recovery from thermal and hypoxic stress requires about 3 and 2 days, respectively, with >3 days needed for re-acclimation to freshwater for seawater acclimated fish. The study also found non-additive (synergistic) effects of multiple stressors on mortality risk. Importantly, osmotic stress associated with de-smolts was the most important predictor of mortality. In saltwater, de-smolts exposed to salinity, high temperature, and hypoxia experienced a 9-fold increase in mortality compared to those only exposed to saltwater, suggesting a synergistic response to multiple stressors. These findings suggest that delays in hatchery releases to support release of larger fish need to be carefully scrutinized to ensure fish are not being released as de-smolts, which are highly susceptible to additional climate-induced stressors like rising temperatures and reduced dissolved oxygen levels in the marine environment.

Abstract Identifying early gene expression responses to hypoxia (i.e., low dissolved oxygen) as a tool to assess the degree of exposure to this stressor is crucial for salmonids, because they are increasingly exposed to hypoxic stress due to anthropogenic habitat change, e.g., global warming, excessive nutrient loading, and persistent algal blooms. Our goal was to discover and validate gill gene expression biomarkers specific to the hypoxia response in salmonids across multi-stressor conditions. Gill tissue was collected from 24 freshwater juvenile Chinook salmon ( Oncorhynchus tshawytscha ), held in normoxia [dissolved oxygen (DO) > 8 mg L −1 ] and hypoxia (DO = 4□5 mg L −1 ) in 10 and 18°C temperatures for up to six days. RNA-sequencing (RNA-seq) was then used to discover 240 differentially expressed genes between hypoxic and normoxic conditions, but not affected by temperature. The most significantly differentially expressed genes had functional roles in the cell cycle and suppression of cell proliferation associated with hypoxic conditions. The most significant genes (n = 30) were selected for real-time qPCR assay development. These assays demonstrated a strong correlation (r = 0.88; p < 0.001) between the expression values from RNA-seq and the fold changes from qPCR. Further, qPCR of the 30 candidate hypoxia biomarkers was applied to an additional 322 Chinook salmon exposed to hypoxic and normoxic conditions to reveal the top biomarkers to define hypoxic stress. Multivariate analyses revealed that smolt stage, water salinity, and morbidity status were relevant factors to consider with the expression of these genes in relation to hypoxic stress. These hypoxia candidate genes will be put into application screening Chinook salmon to determine the identity of stressors impacting the fish.