Abstract Sequential proteolysis of the amyloid precursor protein (APP) and amyloid-β peptide (Aβ) release is an upstream event in Alzheimer’s disease (AD) pathogenesis. The function of APP in neuronal physiology is still, however, poorly understood. Along with its paralog APP-like Proteins 1 and 2 (APLP1-2), APP is involved in neurite formation and synaptic function by mechanisms that are not elucidated. APP is a single-pass transmembrane protein expressed at high levels in the brain that resembles a cell adhesion molecule or a membrane receptor, suggesting that its function relies on cell interaction processes and/or activation of intracellular pathways of signal transduction. Along this line, the APP intracellular domain (AICD) was reported to act as a transcriptional factor for targeted gene activation that mediates physiological APP functions. Here, we used an unbiased transcriptome-based approach to identify the genes transcriptionally regulated by APP in the rodent embryonic cortex and upon maturation of primary cortical neurons. The transcriptome analysis did not detect any significant differences in expression of previously proposed AICD target genes. The overall transcriptional changes were subtle, but we found that genes clustered in neuronal-activity dependent pathways are dysregulated in the absence of APP. Among these genes, we found the activity-dependent Neuronal PAS domain protein 4 (NPAS4) Immediate Early Gene to be downregulated in the absence of APP. Down-regulation of NPAS4 in APP knock-out (KO) neurons is not related to AICD but to the APP ectodomain. We studied the effect of APP deficiency on GABAergic and glutamatergic transmission, and found an increased production of the inhibitory neurotransmitter GABA in APP KO neurons, along with a reduced expression of the GABA(A) receptors alpha1, suggesting an impaired GABAergic neurotransmission in the absence of APP. CRISPR-Cas-mediated silencing of NPAS4 in neurons led to similar observations. Altogether, our results point out a new role for APP in the regulation of excitatory/inhibitory neurotransmission through the regulation of the activity-dependent NPAS4 gene.

Abstract Presenilins 1 and 2 (PS1 and PS2) are predominantly known as the catalytic subunits of the γ-secretase complex which generates the amyloid-β (Aβ) peptide, the major constituent of the senile plaques found in the brain of Alzheimer’s disease (AD) patients. Apart from their role in γ-secretase activity, a growing number of cellular functions have been recently attributed to PSs. They are involved in synaptic transmission, endo-lysosomal function and calcium homeostasis. PSs were also found to be enriched in mitochondria-associated membranes (MAMs) where mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) interact. PS2 was more specifically reported to regulate calcium shuttling between the ER and mitochondria by controlling the formation of functional MAMs through its interaction with the Mitofusin2 protein. We have previously demonstrated that the absence of PS2 (PS2KO) alters mitochondrial morphology and function. Indeed, a PS2KO cell line showed reduced mitochondrial respiration along with disrupted mitochondrial cristae and increased glycolysis. This phenotype is restored by the stable re-expression of human PS2. Still, all these results were obtained in immortalized Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) and one bottom-line question is to know whether these observations hold true for the Central Nervous System (CNS) cells, and in particular neurons and astrocytes. To that end, we carried out primary PS1KO, PS2KO and PS1/PS2KO (PSdKO) neuronal and astrocyte cultures. All the conditions were obtained in the same litter by crossing PS2 heterozygous and PS1 floxed (PS2 +/− ; PS1 flox/flox ) animals. Indeed, contrary to PS2KO mice, PS1KO are not viable and therefore require the use of the Cre-LoxP system to achieve gene deletion in vitro . Strikingly, we did not observe any mitochondrial phenotype in PS1KO, PS2KO or PSdKO primary cultures. Mitochondrial respiration and membrane potential were similar in all models, as were the glycolytic flux and NAD + /NADH ratio. We further investigated the discrepancies between these results and the ones previously reported in the MEF PS2KO cell line by analyzing PS2KO primary fibroblasts. No mitochondrial dysfunction was observed in this model, in line with observations in PS2KO primary neurons and astrocytes. These results indicate that the mitochondrial phenotype observed in immortalized PS2-deficient cell lines cannot be extrapolated to primary neurons, astrocytes and even to primary fibroblasts. The PS-dependent mitochondrial phenotype reported so far might be the consequence of a cell immortalization process and, therefore, should be critically reconsidered regarding its relevance to AD.

Abstract A key hallmark of Alzheimer’s disease (AD) is the extracellular deposition of amyloid plaques composed primarily of the amyloidogenic amyloid-β (Aβ) peptide. The Aβ peptide is a product of sequential cleavage of the Amyloid Precursor Protein (APP), the first step of which gives rise to a C-terminal Fragment (C99). Cleavage of C99 by γ-secretase activity releases Aβ of several lengths and the Aβ42 isoform in particular has been identified as being neurotoxic. The misfolding of Aβ leads to subsequent amyloid fibril formation by nucleated polymerisation. This requires an initial and critical nucleus for self-assembly. Here, we identify and characterise the composition and self-assembly properties of cell-derived hexameric Aβ42 and show its nucleating properties which are dependent on the Aβ monomer availability. Identification of nucleating assemblies that contribute to self-assembly in this way may serve as therapeutic targets to prevent the formation of toxic oligomers.

Abstract Background The β-amyloid peptide (Aβ) plays a key role in Alzheimer’s disease. After its production by catabolism of the amyloid precursor protein (APP) through the action of presenilin 1 (PS1)- or presenilin 2 (PS2)-dependent γ-secretases, monomeric Aβ can assemble in oligomers. In a pathological context, this eventually leads to the formation of fibrils, which deposit in senile plaques. Many studies suggest that Aβ toxicity is related to its soluble oligomeric intermediates. Among these, our interest focuses on hexameric Aβ, which acts as a nucleus for Aβ self-assembly. Methods Biochemical analyses were used to identify hexameric Aβ in a wide range of models; cell lines, cerebrospinal fluid from cognitively impaired patients and transgenic mice exhibiting human Aβ pathology (5xFAD). We isolated this assembly and assessed both its effect on primary neuron viability in vitro , and its contribution to amyloid deposition in vivo following intracerebral injection. In both cases, we used wild-type mice (C57BL/6) to mimic an environment where hexameric Aβ is present alone and 5xFAD mice to incubate hexameric Aβ in a context where human Aβ species are pre-existing. Using CRISPR-Cas9, we produced stable knockdown human cell lines for either PS1 or PS2 to elucidate their contribution to the formation of hexameric Aβ. Results In WT mice, we found that neither in vitro or in vivo exposure to hexameric Aβ was sufficient to induce cytotoxic effects or amyloid deposition. In 5xFAD mice, we observed a significant increase in neuronal death in vitro following exposure to 5μM hexameric Aβ, as well as a 1.47-fold aggravation of amyloid deposition in vivo . At the cellular level, we found hexameric Aβ in extracellular vesicles and observed a strong decrease in its excretion when PS2 was knocked down by 60%. Conclusions Our results indicate the absence of cytotoxic effects of cell-derived hexameric Aβ by itself, but its capacity to aggravate amyloid deposition by seeding other Aβ species. We propose an important role for PS2 in the formation of this particular assembly in vesicular entities, in line with previous reports linking the restricted location of PS2 in acidic compartments to the production of more aggregation-prone Aβ.