The ability of Cryptococcus neoformans to cause disease in humans varies significantly among strains with highly related genotypes. In general, environmental isolates of pathogenic species such as C. neoformans var. grubii have reduced virulence relative to clinical isolates, despite having no differences in the expression of the canonical virulence traits (high temperature growth, melanization and capsule formation). In this observation, we report that environmental isolates of C. neoformans tolerate host CO2 concentrations poorly compared to clinical isolates and that CO2 tolerance correlates well with the ability of the isolates to cause disease in mammals. Initial experiments also suggest that CO2 tolerance is particularly important for dissemination of C. neoformans from the lung to the brain. Furthermore, CO2 concentrations affect the susceptibility of both clinical and environmental C. neoformans isolates to the azole class of antifungal drugs, suggesting that antifungal testing in the presence of CO2 may improve the correlation between in vitro azole activity and patient outcome.

Cryptococcus neoformans is a ubiquitous soil fungus and airborne pathogen that causes over 180,000 deaths each year. Cryptococcus must adapt to host CO

Nickel (Ni) is an abundant element on Earth and it can be toxic to all forms of life. Unlike our knowledge of other metals, little is known about the biochemical response to Ni overload. Previous studies in mammals have shown that Ni induces various physiological changes including redox stress, hypoxic responses, as well as cancer progression pathways. However, the primary cellular targets of nickel toxicity are unknown. Here, we used the environmental fungus Cryptococcus neoformans as a model organism to elucidate the cellular response to exogenous Ni. We discovered that Ni causes alterations in ergosterol (the fungal equivalent of mammalian cholesterol) and lipid biosynthesis, and that the Sterol Regulatory Element-Binding transcription factor Sre1 is required for Ni tolerance. Interestingly, overexpression of the C-4 methyl sterol oxidase gene ERG25, but not other genes in the ergosterol biosynthesis pathway tested, increases Ni tolerance in both the wild type and the sre1Δ mutant. Overexpression of ERG25 with mutations in the predicted binding pocket to a metal cation cofactor sensitizes Cryptococcus to nickel and abolishes its ability to rescue the Ni-induced growth defect of sre1Δ. As overexpression of a known nickel-binding protein Ure7 or Erg3 with a metal binding pocket similar to Erg7 does not impact on nickel tolerance, Erg25 does not appear to simply act as a nickel sink. Furthermore, nickel induces more profound and specific transcriptome changes in ergosterol biosynthetic genes compared to hypoxia. We conclude that Ni targets the sterol biosynthesis pathway primarily through Erg25 in fungi. Similar to the observation in C. neoformans, Ni exposure reduces sterols in human A549 lung epithelial cells, indicating that nickel toxicity on sterol biosynthesis is conserved.

Abstract The environmental pathogen Cryptococcus neoformans claims over 180,000 lives each year. Survival of this basidiomycete at host CO 2 concentrations has only recently been considered an important virulence trait. Through screening gene knockout libraries constructed in a CO 2 -tolerant clinical strain, we found mutations leading to CO 2 sensitivity are enriched in pathways activated by heat stress, including calcineurin, Ras1-Cdc24, cell wall integrity, and Regulator of Ace2 and Morphogenesis (RAM). Overexpression of Cbk1, the conserved terminal kinase of the RAM pathway, partially restored defects of these mutants at host CO 2 or temperature levels. In ascomycetes such as Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans , transcription factor Ace2 is an important target of Cbk1, activating genes responsible for cell separation. However, no Ace2 homolog or any downstream component of the RAM pathway has been identified in basidiomycetes. Through in vitro evolution and comparative genomics, we characterized mutations in suppressors of cbk1 Δ in C. neoformans that partially rescued defects in CO 2 tolerance, thermotolerance, and morphology. One suppressor is the RNA translation repressor Ssd1, which is highly conserved in ascomycetes and basidiomycetes. The other is a novel ribonuclease domain-containing protein, here named PSC1 , which is present in basidiomycetes and humans but surprisingly absent in most ascomycetes. Loss of Ssd1 in cbk1 Δ partially restored cryptococcal ability to survive and amplify in the inhalation and intravenous murine models of cryptococcosis. Our discoveries highlight the overlapping regulation of CO 2 tolerance and thermotolerance, the essential role of the RAM pathway in cryptococcal adaptation to the host condition, and the potential importance of post-transcriptional control of virulence traits in this global pathogen.

ABSTRACT Candida albicans causes life-threatening disseminated candidiasis. Individuals at greatest risk have weakened immune systems. An outer cell wall, exopolysaccharide matrix, and biofilm rich in oligoglucans and oligomannans help Candida spp. evade host defenses. Even after antifungal drug treatment the one-year mortality rate exceeds 25%. Undoubtedly there is room to improve antifungal drug performance. The mammalian C-type lectin pathogen receptors Dectin-1 and Dectin-2 bind to fungal oligoglucans and oligomannans, respectively. We previously coated amphotericin B-loaded liposomes, AmB-LLs, pegylated analogs of AmBisome, with the ligand binding domains of these two Dectins. DectiSomes, DEC1-AmB-LLs and DEC2-AmB-LLs, showed two distinct patterns of binding to the exopolysaccharide matrix surrounding C. albicans hyphae grown in vitro, while untargeted AmB-LLs did not bind. DectiSomes were preferentially associated with fungal colonies in the kidneys. In a neutropenic mouse model of candidiasis, DEC1-AmB-LLs and DEC2-AmB-LLs delivering only one dose of 0.2 mg/kg AmB significantly reduced the kidney fungal burden several fold relative to AmB-LLs, based on either colony forming units (P= 0.013 to 8.8 × 10 -5 ) or quantitative PCR of fungal rRNA ITS (P= 5.5×10 -5 to 3.0×10 -10 ). DEC1-AmB-LLs and DEC2-AmB-LLs significantly increased the percent of surviving mice relative to AmB-LLs. Dectin-2 targeted anidulafungin loaded liposomes and AmBisomes, DEC2-AFG-LLs and DEC2-AmBisome reduced fungal burden in the kidneys several fold over their untargeted counterparts (P=7.8×10 -5 and 0.0020, respectively). The data herein suggest that targeting of a variety of antifungal drugs to fungal glycans may achieve lower safer effective doses and improve drug efficacy against a variety of invasive fungal infections.

Aspergillus species cause pulmonary invasive aspergillosis resulting in nearly a hundred thousand deaths each year. Patients at the greatest risk of developing life-threatening aspergillosis have weakened immune systems and/or various lung disorders. Patients are treated with antifungals such as amphotericin B (AmB), casofungin acetate, or triazoles (itraconazole, voriconazole etc.), but these antifungal agents have serious limitations due to lack of sufficient fungicidal effect and human toxicity. Liposomes with AmB intercalated into the lipid membrane (AmBisomes, AmB-LLs), have several-fold reduced toxicity compared to detergent solubilized drug. However, even with the current antifungal therapies, one-year survival among patients is only 25 to 60%. Hence, there is a critical need for improved antifungal therapeutics. Dectin-1 is a mammalian innate immune receptor in the membrane of some leukocytes that binds as a dimer to beta-glucans found in fungal cell walls, signaling fungal infection. Using a novel protocol, we coated AmB-LLs with Dectin-1's beta-glucan binding domain to make DEC-AmB-LLs. DEC-AmB-LLs bound rapidly, efficiently, and with great strength Aspergillus fumigatus and to Candida albicans and Cryptococcus neoformans, highly divergent fungal pathogens of global importance. By contrast, un-targeted AmB-LLs and BSA-coated BSA-AmB-LLs showed 200-fold lower affinity for fungal cells. DEC-AmB-LLs reduced the growth and viability of A. fumigatus an order of magnitude more efficiently than untargeted control liposomes delivering the same concentrations of AmB, in essence increasing the effective dose of AmB. Future efforts will focus on examining pan-antifungal targeted liposomal drugs in animal models of disease.

Abstract Antigen presentation, as the initial step in inducing the activation of T lymphocytes, plays a crucial role in antitumor response. Studies concentrating on major histocompatibility complex class II (MHC II) molecules and the activated CD4 + helper T (Th) cells have gained popularity in light of the past limited efficacy of MHC I‐activated CD8 + T cells alone. In general, MHC II is canonically expressed by professional antigen‐presenting cells (pAPCs), yet attempts to increase antigen presentation by dendritic cell (DC) activation have mostly been unsuccessful. In recent years, a number of studies have found that a variety of cells, including cancer cells, fibroblasts, vascular endothelial cells (VECs), and lymphoid stromal cells (LSCs), are considered amateur APCs (aAPCs) and can express MHC II molecules, which have piqued the interest of researchers. These groups vastly outnumber DCs or macrophages, and it has been confirmed that they also qualify as antigen‐presenting complexes that are functionally related to conventional pAPCs. Herein, we will review current research regarding the antigen presentation process of MHC II, its advances in APC surfaces, especially for aAPCs, the special mechanisms of regulation of MHC II on aAPCs, and combination therapy targeting MHC II as a possible treatment strategy in cancer.