The zebrafish heart has the capacity to regenerate after ventricular resection. Although this regeneration model has proved useful for the elucidation of certain regeneration mechanisms, it is based on the removal of heart tissue rather than its damage. Here, we characterize the cellular response and regenerative capacity of the zebrafish heart after cryoinjury, an alternative procedure that more closely models the pathophysiological process undergone by the human heart after myocardial infarction (MI). Localized damage was induced in 25% of the ventricle by cryocauterization (CC). During the first 24 hours post-injury, CC leads to cardiomyocyte death within the injured area and the near coronary vasculature. Cell death is followed by a rapid proliferative response in endocardium, epicardium and myocardium. During the first 3 weeks post-injury cell debris was cleared and the injured area replaced by a massive scar. The fibrotic tissue was subsequently degraded and replaced by cardiac tissue. Although animals survived CC, their hearts showed nonhomogeneous ventricular contraction and had a thickened ventricular wall, suggesting that regeneration is associated with processes resembling mammalian ventricular remodeling after acute MI. Our results provide the first evidence that, like mammalian hearts, teleost hearts undergo massive fibrosis after cardiac damage. Unlike mammals, however, the fish heart can progressively eliminate the scar and regenerate the lost myocardium, indicating that scar formation is compatible with myocardial regeneration and the existence of endogenous mechanisms of scar regression. This finding suggests that CC-induced damage in zebrafish could provide a valuable model for the study of the mechanisms of scar removal post-MI.

During heart regeneration in the zebrafish, fibrotic tissue is replaced by newly formed cardiomyocytes derived from pre-existing ones. It is unclear whether the heart is comprised of several cardiomyocyte populations bearing different capacity to replace lost myocardium. Here, using sox10 genetic fate mapping, we identified a subset of pre-existent cardiomyocytes in the adult zebrafish heart with a distinct gene expression profile that expanded massively after cryoinjury. Genetic ablation of sox10+ cardiomyocytes severely impaired cardiac regeneration revealing that they play a crucial role for heart regeneration.

Unlike adult mammals, zebrafish are able to naturally regenerate their heart. A key mechanism in zebrafish heart regeneration is the activation of the epicardium, leading to the establishment of a supporting scaffold for newly formed cardiomyocytes, angiogenesis and cytokine secretion. Neuropilins (NRPs) are cell surface co-receptors mediating functional signaling of kinase receptors for cytokines known to play critical roles in zebrafish heart regeneration, including Platelet-Derived growth factor (PDGF), Vascular Endothelial growth factor (VEGF), and Fibroblast growth factor (FGF). Herein, we investigated the role of neuropilins in the response of the zebrafish heart to injury and its subsequent regeneration. All four zebrafish neuropilin isoforms, nrp1a, 1b, 2a, and 2b, were upregulated following cardiac cryoinjury and were strongly expressed by the activated epicardium. A nrp1a mutant, coding for a truncated, non-functional protein, showed a significant delay in heart regeneration in comparison to Wild-Type fish and displayed persistent collagen deposition. The regenerating hearts of nrp1a mutants were less vascularized and epicardial-derived cell migration and re-expression of the developmental gene Wilms tumor 1 was severely impaired in nrp1a mutants. Moreover, cryoinjury-induced activation and migration of epicardial cells in heart explants was strongly reduced in nrp1a mutant zebrafish. These results identify a key role for Nrp1 in zebrafish heart regeneration, mediated through epicardial activation, migration and revascularization.

Cardiac valve disease can lead to severe cardiac dysfunction and is thus a frequent cause of morbidity and mortality. Its main treatment is valve replacement, which is currently greatly limited by the poor recellularization and tissue formation potential of the implanted valves. As we still lack suitable animal models to identify modulators of these processes, here we used the adult zebrafish and found that, upon valve decellularization, they initiate a striking regenerative program that leads to the formation of new functional valves. After injury, endothelial and kidney marrow-derived cells undergo cell cycle re-entry and differentiate into new extracellular matrix-secreting valve cells. The Transforming Growth Factor beta (TGFβ) signaling pathway promotes this process by enhancing progenitor cell proliferation as well as valve cell differentiation. These findings reveal a key role for TGFβ signaling in valve regeneration and also establish the zebrafish as a model to identify and test factors promoting valve recellularization and growth.

Cilia and the intraflagellar transport (IFT) proteins involved in ciliogenesis are associated with congenital heart diseases (CHD). However, the molecular links between cilia, IFT proteins and cardiogenesis are yet to be established. Using a combination of biochemistry, genetics, and live imaging methods, we show that IFT complex B proteins (Ift88, Ift54 and Ift20) modulate the Hippo pathway effector YAP1 in zebrafish and mouse. We demonstrate that this interaction is key to restrict the formation of the proepicardium and the myocardium. In cellulo experiments suggest that IFT88 and IFT20 interact with YAP1 in the cytoplasm and functionally modulates its activity, identifying a molecular link between cilia related proteins and the Hippo pathway. Taken together, our results highlight a novel role for IFT complex B proteins during cardiogenesis and shed light on an unexpected mechanism of action for ciliary proteins in YAP1 regulation. These findings provide mechanistic insights into a non-canonical role for cilia related proteins during cardiogenesis.

In the zebrafish (Danio rerio), regeneration and fibrosis after cardiac injury are not mutually exclusive responses. Upon cardiac cryoinjury, collagen and other extracellular matrix (ECM) proteins accumulate at the injury site. However, in contrast to the situation in mammals, fibrosis is transient in zebrafish and its regression is concomitant with regrowth of the myocardial wall. Little is known about the cells producing this fibrotic tissue or how it resolves. Using novel genetic tools to mark periostin b- and collagen 1alpha2 (col1a2)-expressing cells in combination with transcriptome analysis, we explored the sources of activated fibroblasts and traced their fate. We describe that during fibrosis regression, fibroblasts are not fully eliminated, but become inactivated. Unexpectedly, limiting the fibrotic response by genetic ablation of col1a2-expressing cells impaired cardiomyocyte proliferation. We conclude that ECM-producing cells are key players in the regenerative process and suggest that anti-fibrotic therapies might be less efficient than strategies targeting fibroblast inactivation.

The oxidative phosphorylation (OXPHOS) system is a dynamic system in which the respiratory complexes coexist with super-assembled quaternary structures called supercomplexes (SCs). The physiological role of SCs is still disputed. Here we used zebrafish to study the relevance of respiratory SCs. We combined immunodetection analysis and deep data-independent proteomics to characterize these structures and found similar SCs to those described in mice, as well as novel SCs including III2+IV2, I+IV and I+III2+IV2. To study the physiological role of SCs, we generated two null allele zebrafish lines for supercomplex assembly factor 1 (SCAF1). SCAF1-/- fish displayed altered OXPHOS activity due to the disrupted interaction of complex III and IV. SCAF1-/- fish were smaller in size, and showed abnormal fat deposition and decreased female fertility. These physiological phenotypes were rescued by doubling the food supply, which correlated with improved bioenergetics and alterations in the metabolic gene expression program. These results reveal that SC assembly by SCAF1 modulates OXPHOS efficiency and allows for the optimization of metabolic resources.

The epicardium, the outer mesothelial layer enclosing the myocardium, plays key roles in heart development and regeneration. During embryogenesis it arises from the proepicardium (PE), a cell cluster that appears in the dorsal pericardium close to the venous pole of the heart. Little is known about how the PE emerges from the pericardial mesothelium. Using the zebrafish model and a combination of genetic tools, pharmacological agents and quantitative in vivo imaging we reveal that a coordinated collective movement of the dorsal pericardium drives PE formation. We found that PE cells are apically extruded in response to actomyosin activity. Our results reveal that the coordinated action of Notch/Bmp pathways is critically needed for apical extrusion of PE cells. More generally, by comparison to cell extrusion for the elimination of unfit cells from epithelia, our results describe a unique mechanism where extruded cell viability is maintained.

Abstract Autophagy-lysosomal degradation is an evolutionarily conserved process key to cellular homeostasis, differentiation, and stress survival, which is particularly important for the cardiovascular system. Furthermore, experimental and clinical observations indicate it affects cardiac morphogenesis, including valve development. However, the cell-specificity and functional role of autophagic processes during heart development remain unclear. Here, we introduce novel zebrafish models to visualize autophagic vesicles in vivo and follow their temporal and cellular localization in the larval heart. We observed a significant accumulation of lysosomal vesicles in the developing atrioventricular and bulboventricular regions and their respective valves. Next, we addressed the role of lysosomal degradation using a Spinster homolog 1 ( spns1 ) mutant. spns1 mutants displayed morphological and functional cardiac defects, including abnormal endocardial organization, impaired valve formation and retrograde blood flow. Single-nuclear transcriptome analysis revealed endocardial-specific differences in the expression of lysosome-related genes and alterations of notch1- signalling in the mutant. Endocardial-specific overexpression of spns1 and notch1 rescued features of valve formation and function. Altogether, our study reveals a cell-autonomous role of lysosomal processing during cardiac valve formation upstream of notch1- signalling.

Abstract The mesothelium forms epithelial membranes that line the bodies cavities and surround the internal organs. Mesothelia widely contribute to organ homeostasis and regeneration, and their dysregulation can result in congenital anomalies of the viscera, ventral wall defects, and mesothelioma tumors. Nonetheless, the embryonic ontogeny and developmental regulation of mesothelium formation has remained uncharted. Here, we combine genetic lineage tracing, in toto live imaging, and single-cell transcriptomics in zebrafish to track mesothelial progenitor origins from the lateral plate mesoderm (LPM). Our single-cell analysis uncovers a post-gastrulation gene expression signature centered on hand2 that delineates distinct progenitor populations within the forming LPM. Combining gene expression analysis and imaging of transgenic reporter zebrafish embryos, we chart the origin of mesothelial progenitors to the lateral-most, hand2 -expressing LPM and confirm evolutionary conservation in mouse. Our time-lapse imaging of transgenic hand2 reporter embryos captures zebrafish mesothelium formation, documenting the coordinated cell movements that form pericardium and visceral and parietal peritoneum. We establish that the primordial germ cells migrate associated with the forming mesothelium as ventral migration boundary. Functionally, hand2 mutants fail to close the ventral mesothelium due to perturbed migration of mesothelium progenitors. Analyzing mouse and human mesothelioma tumors hypothesized to emerge from transformed mesothelium, we find de novo expression of LPM-associated transcription factors, and in particular of Hand2, indicating the re-initiation of a developmental transcriptional program in mesothelioma. Taken together, our work outlines a genetic and developmental signature of mesothelial origins centered around Hand2, contributing to our understanding of mesothelial pathologies and mesothelioma.