The core of the eukaryotic helicase MCM is loaded as an inactive double hexamer (DH). How it is assembled into two active Cdc45-MCM-GINS (CMG) helicases remains elusive. Here, we report that at the onset of S phase, both Cdc45 and GINS are loaded as dimers onto MCM DH, resulting in formation of double CMG (d-CMG). As S phase proceeds, d-CMGs gradually mature into two single CMG-centered replisome progression complexes (RPCs). Mass spectra reveal that RPA and DNA Pol α/primase co-purify exclusively with RPCs, but not with d-CMGs. Consistently, d-CMGs are not able to catalyze either the unwinding or de novo DNA synthesis, while RPCs can do both. Using single-particle electron microscopy, we have obtained 2D class averages of d-CMGs. Compared to MCM DHs, they display heterogeneous, flexibly orientated and partially loosened conformations with changed interfaces. The dumbbell-shaped d-CMGs are mediated by Ctf4, while other types of d-CMGs are independent of Ctf4. These data suggest CMG dimers as bona fide intermediates during MCM maturation, providing an additional quality control for symmetric origin activation and bidirectional replication.

Cohesin acetyltransferases Esco1 and Esco2 play a vital role in establishing sister chromatid cohesion. How Esco1 and Esco2 are controlled to achieve this in a DNA replication-coupled manner remains unclear in higher eukaryotes. Here we show that Cul4-RING ligases (CRL4s) play a critical role in sister chromatid cohesion in human cells. Depletion of Cul4A, Cul4B or Ddb1 subunits substantially reduces normal cohesion efficiency. We also show that Mms22L, a vertebrate ortholog of yeast Mms22, is one of Ddb1 and Cul4-associated factors (DCAFs) involved in cohesion. Several lines of evidence suggest a selective interaction of CRL4s with Esco2, but not Esco1. Depletion of either CRL4s or Esco2 causes a defect in Smc3 acetylation which can be rescued by HDAC8 inhibition. More importantly, both CRL4s and PCNA act as mediators for efficiently stabilizing Esco2 on chromatin and catalyzing Smc3 acetylation. Taken together, we propose an evolutionarily conserved mechanism in which CRL4s and PCNA regulate Esco2-dependent establishment of sister chromatid cohesion.

The S-phase checkpoint plays an essential role in regulation of the ribonucleotide reductase (RNR) activity to maintain the dNTP pools. How eukaryotic cells respond appropriately to different levels of replication threats remains elusive. Here, we have identified that a conserved GSK-3 kinase Mck1 cooperates with Dun1 in regulating this process. Deleting MCK1 sensitizes dun1Δ to hydroxyurea (HU) reminiscent of mec1Δ or rad53Δ. As a kinase at the downstream of Rad53, Mck1 does not participate in the post-translational regulation of RNR as Dun1 does, but Mck1 can release the Crt1 repressor from the promoters of RNR2/3/4 by phosphorylation. Meanwhile, Hug1, an Rnr2 inhibitor, is induced to fine-tune the dNTP levels. When cells suffer a more severe threat, Mck1 can inhibit the transcription of HUG1. Importantly, only a combined deletion of HUG1 and CRT1, can confer a dramatic boost of dNTP levels and the survival of mck1Δdun1Δ or mec1Δ cells assaulted by a lethal dose of HU. These findings reveal the division-of-labor between Mck1 and Dun1 at the S-phase checkpoint pathway to fine-tune dNTP homeostasis

Abstract RB1 (retinoblastoma) members control the G1/S commitment as transcriptional repressors in eukaryotic cells. Here we uncover that an extra copy of RB1 equivalent ( WHI7 or WHI5 ) is sufficient to bypass the indispensability of the central genomic checkpoint kinases Mec1 ATR -Rad53 CHK1 in Saccharomyces cerevisiae . Mec1-Rad53 directly phosphorylate Whi7/5, antagonizing their nuclear export or protein turnover upon replication stress. Through in vitro reconstitution, we show that Whi7 C-terminus directly binds and hinders S-CDK-Cks1 from processively phosphorylating Sic1. By microfluidic single-cell real-time quantitative imaging, we demonstrate that both Whi7 and Whi5 are required to flatten the degradation curve of the major S-CDK inhibitor Sic1 in vivo. These findings reveal an eclipsed transcription-independent role of Whi7 homologs, which is highlighted by genome integrity checkpoints to hold the G1/S transition instantly as a rapid response to unforeseeable replication threats. Key points Whi7 overexpression bypasses the essential function of Mec1 and Rad53 in a transcription-independent way. Whi7 is stabilized by checkpoint-mediated phosphorylation. Whi7 binds and hinders S-CDK-Cks1 from multi-phosphorylation of Sci1, thereby prolonging Sic1 degradation and G1/S transition.

Sister chromatid cohesion is established by Eco1 in S phase. Nevertheless, the exact consequence of Eco1-catalyzed acetylation is unknown, and the cohesive state remains highly controversial. Here we show that self-interactions of cohesin subunits Scc1/Rad21 and Scc3 occur in a DNA replication-coupled manner in both yeast and human. Through cross-linking mass spectrometry and VivosX analysis of purified cohesin, we show that a subpopulation of cohesin may exist as dimers. Importantly, cohesin-cohesin interaction becomes significantly compromised when Eco1 is depleted. On the other hand, deleting either deacetylase Hos1 or Eco1 antagonist Wpl1/Rad61 results in an increase (e.g., from ~20% to 40%) of cohesin dimers. These findings suggest that cohesin dimerization is controlled by common mechanisms as the cohesion cycle, thus providing an additional layer of regulation for cohesin to execute various functions such as sister chromatid cohesion, DNA repair, gene expression, chromatin looping and high-order organization.