We present a 1 Mpixel single-photon avalanche diode camera featuring 3.8 ns time gating and 24 kfps frame rate, fabricated in 180 nm CMOS image sensor technology. We designed two pixels with a pitch of 9.4 µm in 7 T and 5.75 T configurations respectively, achieving a maximum fill factor of 13.4%. The maximum photon detection probability is 27%, median dark count rate is 2.0 cps, variation in gating length is 120 ps, position skew is 410 ps, and rise/fall time is < 550  p s , all FWHM at 3.3 V excess bias. The sensor was used to capture 2D/3D scenes over 2 m with resolution (least significant bit) of 5.4 mm and precision better than 7.8 mm (rms). We demonstrate extended dynamic range in dual exposure operation mode and show spatially overlapped multi-object detection in single-photon time-gated time-of-flight experiments.

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is a key technology that provides direct insight into cell metabolism, cell dynamics and protein activity. However, determining the lifetimes of different fluorescent proteins requires the detection of a relatively large number of photons, hence slowing down total acquisition times. Moreover, there are many cases, for example in studies of cell collectives, where wide-field imaging is desired. We report scan-less wide-field FLIM based on a 0.5 Megapixel resolution, time-gated Single Photon Avalanche Diode (SPAD) camera, with acquisition rates up to 1 Hz. Fluorescence lifetime estimation is performed via a pre-trained artificial neural network with 1000-fold improvement in processing times compared to standard least squares fitting techniques. We utilised our system to image HT1080 – human fibrosarcoma cell line as well as Convallaria. The results show promise for real-time FLIM and a viable route towards multi-megapixel fluorescence lifetime images, with a proof-of-principle mosaic image shown with 3.6 megapixels.

SignificanceFluorescence guidance is used clinically by surgeons to visualize anatomical and/or physiological phenomena in the surgical field that are difficult or impossible to detect by the naked eye. Such phenomena include tissue perfusion or molecular phenotypic information about the disease being resected. Conventional fluorescence-guided surgery relies on long, microsecond scale laser pulses to excite fluorescent probes. However, this technique only provides two-dimensional information; crucial depth information, such as the location of malignancy below the tissue surface, is not provided.AimWe developed a depth sensing imaging technique using light detection and ranging (LiDAR) time-of-flight (TOF) technology to sense the depth of target tissue while overcoming the influence of tissue optical properties and fluorescent probe concentration.ApproachThe technology is based on a large-format (512×512 pixel), binary, gated, single-photon avalanche diode (SPAD) sensor with an 18 ps time-gate step, synchronized with a picosecond pulsed laser. The fast response of the sensor was developed and tested for its ability to quantify fluorescent inclusions at depth and optical properties in tissue-like phantoms through analytical model fitting of the fast temporal remission data.ResultsAfter calibration and algorithmic extraction of the data, the SPAD LiDAR technique allowed for sub-mm resolution depth sensing of fluorescent inclusions embedded in tissue-like phantoms, up to a maximum of 5 mm in depth. The approach provides robust depth sensing even in the presence of variable tissue optical properties and separates the effects of fluorescence depth from absorption and scattering variations.ConclusionsLiDAR TOF fluorescence imaging using an SPAD camera provides both fluorescence intensity images and the temporal profile of fluorescence, which can be used to determine the depth at which the signal is emitted over a wide field of view. The proposed tool enables fluorescence imaging at a higher depth in tissue and with higher spatial precision than standard, steady-state fluorescence imaging tools, such as intensity-based near-infrared fluorescence imaging, optical coherence tomography, Raman spectroscopy, or confocal microscopy. Integration of this technique into a standard surgical tool could enable rapid, more accurate estimation of resection boundaries, thereby improving the surgeon's efficacy and efficiency, and ultimately improving patient outcomes.

Diffuse Correlation Spectroscopy (DCS) allows the optical and label-free investigation of microvascular dynamics. Commonly, DCS is implemented with highly sensitive and ultra fast single-photon avalanche diodes (SPAD) for blood flow measurements from around 1-1.5cm deep inside tissue (source detector separation of 2.5-3 cm). In parallelized DCS (pDCS), we use arrays of multiple SPADs to boost the signal-to-noise ratio by averaging many independent DCS measurements. In this study, we explored the capabilities of an innovative, massively parallelized SPAD array with 500x500 single pixels for DCS for up to 250,000 parallel DCS measurements. We can show that this massively parallelized array enables viable blood flow measurements at 2cm depth (4cm source detector separation) in human subjects. Furthermore, we applied a dual detection strategy, where a secondary SPAD array probes the superficial blood flow simultaneously as a build-in reference measurement. In addition to our main results, we test and discuss methods to correct the deep flow measurement, by including simultaneously measured flow dynamics deep and superficial tissue layers via our novel dual-SPAD array measurement setup.

Abstract Near-infrared (NIR) fluorescence lifetime imaging (FLI) provides a unique contrast mechanism to monitor biological parameters and molecular events in vivo . Single-photon avalanche photodiode (SPAD) cameras have been recently demonstrated in FLI microscopy (FLIM) applications, but their suitability for in vivo macroscopic FLI (MFLI) in deep tissues remains to be demonstrated. Herein, we report in vivo NIR MFLI measurement with SwissSPAD2, a large time-gated SPAD camera. We first benchmark its performance in well-controlled in vitro experiments, ranging from monitoring environmental effects on fluorescence lifetime, to quantifying Förster Resonant Energy Transfer (FRET) between dyes. Next, we use it for in vivo studies of target-drug engagement in live and intact tumor xenografts using FRET. Information obtained with SwissSPAD2 was successfully compared to that obtained with a gated-ICCD camera, using two different approaches. Our results demonstrate that SPAD cameras offer a powerful technology for in vivo preclinical applications in the NIR window.

SPAD arrays have shown potential for improving SNR for diffuse correlation spectroscopy in low photon regimes. Here, we will explore different methods of integrating parallelized DCS signals in such regimes for deep blood flow extraction.

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is a powerful imaging technique that enables the visualization of biological samples at the molecular level by measuring the fluorescence decay rate of fluorescent probes. This provides critical information about molecular interactions, environmental changes, and localization within biological systems. However, creating high-resolution lifetime maps using conventional FLIM systems can be challenging, as it often requires extensive scanning that can significantly lengthen acquisition times. This issue is further compounded in three-dimensional (3D) imaging because it demands additional scanning along the depth axis. To tackle this challenge, we developed a computational imaging technique called light-field tomographic FLIM (LIFT-FLIM). Our approach allows for the acquisition of volumetric fluorescence lifetime images in a highly data-efficient manner, significantly reducing the number of scanning steps required compared to conventional point-scanning or line-scanning FLIM imagers. Moreover, LIFT-FLIM enables the measurement of high-dimensional data using low-dimensional detectors, which are typically low cost and feature a higher temporal bandwidth. We demonstrated LIFT-FLIM using a linear single-photon avalanche diode array on various biological systems, showcasing unparalleled single-photon detection sensitivity. Additionally, we expanded the functionality of our method to spectral FLIM and demonstrated its application in high-content multiplexed imaging of lung organoids. LIFT-FLIM has the potential to open up broad avenues in both basic and translational biomedical research.