Restriction-modification (RM) systems are the most ubiquitous bacterial defence systems against bacteriophages. Using genome sequence data, we showed that RM systems are often shared among bacterial strains in a structured way. Examining the network of interconnections between bacterial strains within genera, we found that many strains share more RM systems than expected compared with a suitable null model. We also found that many genera have a larger than expected number of bacterial strains with unique RM systems. We used population dynamics models of closed and open phage-bacteria ecosystems to qualitatively understand the selection pressures that could lead to such network structures with enhanced overlap or uniqueness. In our models, we found that the phages impose a selection pressure that favours bacteria with greater number of RM systems, and higher overlap of RM systems with other strains, but in bacteria-dominated states, this is opposed by the increased cost-to-growth rate of these bacteria. Similar to what we observed in the genome data, we found that two distinct bacterial strategies emerge - strains either have a greater overlap than expected, or, at the other extreme, have unique RM systems. The former strategy appears to dominate when the repertoire of available RM systems is smaller but the average number of RM systems per strain is larger.

The bacterium E. coli can initiate replication in the absence of the replication initiator protein DnaA and / or the canonical origin of replication oriC in a ΔrnhA background. This phenomenon, which can be primed by R-loops, is called constitutive stable DNA replication (cSDR). Whether DNA replication during cSDR initiates in a stochastic manner through the length of the chromosome or at specific sites, and how E. coli can find adaptations to loss of fitness caused by cSDR remain inadequately answered. We use laboratory evolution experiments of ΔrnhA-ΔdnaA followed by deep sequencing to show that DNA replication preferentially initiates within a broad region located ∼0.4-0.7 Mb clockwise of oriC. This region includes many bisulfite-sensitive sites, which have been previously defined as R-loop forming regions; and includes a site containing sequence motifs that favour R-loop formation. Initiation from this region would result in head-on replication-transcription conflicts at rRNA loci. Inversions of these rRNA loci, which can partly resolve these conflicts, help the bacterium suppress the fitness defects of cSDR. These inversions partially restore the gene expression changes brought about by cSDR. The inversion however increases the possibility of conflicts at essential mRNA genes, which would utilise only a miniscule fraction of RNA polymerase molecules most of which transcribe rRNA genes. Whether subsequent adaptive strategies would attempt to resolve these conflicts remains an open question.Importance The bacterium E. coli can replicate its DNA even in the absence of the molecules that are required for canonical replication initiation. This often requires the formation of RNA-DNA hybrid structures, and is referred to as constitutive stable DNA replication (cSDR). Where on the chromosome does cSDR initiate? We answer this question using laboratory evolution experiments and genomics, and show that selection favours cSDR initiation predominantly at a region ∼0.6 Mb clockwise of oriC. Initiation from this site will result in more head on collisions of DNA polymerase with RNA polymerase operating on rRNA loci. The bacterium adapts to this problem by inverting a region of the genome including several rRNA loci such that head-on collisions between the two polymerases are minimised. Understanding such evolutionary strategies in the context of cSDR can provide insights into the potential causes of resistance against antibiotics that target initiation of DNA replication.

Abstract Bacterial genome organisation is primarily driven by chromosome replication from a single origin of replication. However chromosomal rearrangements, which can disrupt such organisation, are inevitable in nature. Long DNA repeats are major players mediating rearrangements, large and small, via homologous recombination. Since changes to genome organisation affect bacterial fitness - and more so in fast-growing than slow-growing bacteria - and are under selection, it is reasonable to expect that genomic positioning of long DNA repeats is also under selection. To test this, we identified identical DNA repeats of at least 100 base pairs across ~6,000 bacterial genomes and compared their distribution in fast and slow growing bacteria. We find that long identical DNA repeats are distributed in a non-random manner across bacterial genomes. Their distribution differs in their overall number, orientation and proximity to the origin of replication, in fast and slow growing bacteria. We show that their positioning - which might arise from a combination of the processes that produce repeats and selection on rearrangements that recombination between repeat elements might cause - permits minimum disruption to the replication-dependent genome organisation of bacteria, thus acting as a major constraint.

ABSTRACT The persistence of Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) is a major problem in managing tuberculosis (TB). Host-generated nitric oxide (NO) is perceived as one of the signals by Mtb to reprogram metabolism and respiration for persistence. However, the mechanisms involved in NO sensing and reorganizing Mtb ’s physiology are not fully understood. Since NO damages Fe-S clusters of essential enzymes, the mechanism(s) involved in regulating iron-sulfur (Fe-S) cluster biogenesis could help Mtb persist in host tissues. Here, we show that a transcription factor SufR (Rv1460) senses NO via its 4Fe-4S cluster and promotes persistence of Mtb by mobilizing the Fe-S cluster biogenesis system; suf operon ( Rv1460-Rv1466 ). Analysis of anaerobically purified SufR by UV-visible spectroscopy, circular dichroism, and iron-sulfide estimation confirms the presence of a 4Fe-4S cluster. Atmospheric O 2 and H 2 O 2 gradually degrade the 4Fe-4S cluster of SufR. Furthermore, electron paramagnetic resonance (EPR) analysis demonstrates that NO directly targets SufR 4Fe-4S cluster by forming a protein-bound dinitrosyl-iron-dithiol complex. DNase I footprinting, gel-shift, and in vitro transcription assays confirm that SufR directly regulates the expression of the suf operon in response to NO. Consistent with this, RNA- sequencing of Mtb Δ sufR demonstrates deregulation of the suf operon under NO stress. Strikingly, NO inflicted irreversible damage upon Fe-S clusters to exhaust respiratory and redox buffering capacity of Mtb Δ sufR . Lastly, Mtb Δ sufR failed to recover from a NO-induced non-growing state and displayed persistence defect inside immune-activated macrophages and murine lungs in a NO-dependent manner. Data suggest that SufR is a sensor of NO that supports persistence by reprogramming Fe-S cluster metabolism and bioenergetics. Highlights Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) induces the expression of suf operon for Fe-S cluster biogenesis in response to nitric oxide (NO). We found that a transcription factor SufR senses NO via its 4Fe-4S cluster and regulates the expression of the suf operon for Fe-S cluster biogenesis. SufR-regulated Fe-S cluster biogenesis confers respiratory and redox features that promote recovery of Mtb from NO stress. SufR activity is required to support the NO-dependent persistence of Mtb in macrophages and mice.