Channelrhodopsins (ChR) are cation channels that can be expressed heterologously in various living tissues, including cardiac and neuronal cells. To tune spatial and temporal control of potentials across ChR-enriched cell membranes, it is essential to understand how pore hydration impacts the ChR photocycle kinetics. Here, we measure channel opening and closing rates of channelrhodopsin chimera and selected variants (C1C2 wild type, C1C2-N297D, C1C2-N297V, and C1C2-V125L) and correlate them with changes in chemical interactions among functionally important residues in both closed and open states. Kinetic results substantiate that replacement of helices I and II in ChR2 with corresponding residues from ChR1, to make the chimera C1C2, affects the kinetics of channelrhodopsin pore gating significantly, making C1C2 a unique channel. As a prerequisite for studies of ion transport, detailed understanding of the water pathway within a ChR channel is important. Our atomistic simulations confirm that opening of the channel and initial hydration of the previously dry gating regions between helices I, II, III, and VII of the channel occurs with 1) the presence of 13-cis retinal; 2) deprotonation of a glutamic acid gating residue, E129; and 3) subsequent weakening of the central gate hydrogen bond between the same glutamic acid E129 and asparagine N282 in the central region of the pore. Also, an aspartate (D292) is the unambiguous primary proton acceptor for the retinal Schiff base in the hydrated channel.

Cation conducting channelrhodopsins (ChRs) are a popular tool used in optogenetics to control the activity of excitable cells and tissues using light. ChRs with altered ion selectivity are in high demand for use in different cell types and for other specialized applications. However, a detailed mechanism of ion permeation in ChRs is not fully resolved. Here, we use complementary experimental and computational methods to uncover the mechanisms of cation transport and valence selectivity through the channelrhodopsin chimera, C1C2, in the high- and low-conducting open states. Electrophysiology measurements identified a single-residue substitution within the central gate, N297D, that increased Ca 2+ permeability vs. Na + by nearly two-fold at peak current, but less so at stationary current. We then developed molecular models of dimeric wild-type C1C2 and N297D mutant channels in both open states and calculated the PMF profiles for Na + and Ca 2+ permeation through each protein using well-tempered/multiple-walker metadynamics. Results of these studies agree well with experimental measurements and demonstrate that the pore entrance on the extracellular side differs from original predictions and is actually located in a gap between helices I and II. Cation transport occurs via a relay mechanism where cations are passed between flexible carboxylate sidechains lining the full length of the pore by sidechain swinging, like a monkey swinging on vines. In the mutant channel, residue D297 enhances Ca 2+ permeability by mediating the handoff between the central and cytosolic binding sites via direct coordination and sidechain swinging. We also found that altered cation binding affinities at both the extracellular entrance and central binding sites underly the distinct transport properties of the low-conducting open state. This work significantly advances our understanding of ion selectivity and permeation in cation channelrhodopsins and provides the insights needed for successful development of new ion-selective optogenetic tools.