The light-gated cation channel channelrhodopsin-2 (ChR2) has rapidly become an important tool in neuroscience, and its use is being considered in therapeutic interventions. Although wild-type and known variant ChR2s are able to drive light-activated spike trains, their use in potential clinical applications is limited by either low light sensitivity or slow channel kinetics. We present a new variant, calcium translocating channelrhodopsin (CatCh), which mediates an accelerated response time and a voltage response that is ~70-fold more light sensitive than that of wild-type ChR2. CatCh's superior properties stem from its enhanced Ca²(+) permeability. An increase in [Ca²(+)](i) elevates the internal surface potential, facilitating activation of voltage-gated Na(+) channels and indirectly increasing light sensitivity. Repolarization following light-stimulation is markedly accelerated by Ca²(+)-dependent BK channel activation. Our results demonstrate a previously unknown principle: shifting permeability from monovalent to divalent cations to increase sensitivity without compromising fast kinetics of neuronal activation. This paves the way for clinical use of light-gated channels.

Abstract Zinc is an essential micronutrient that plays a role in the structural or enzymatic functions of many cellular proteins. Cellular zinc homeostasis involves the opposing action of two families of metal transporters: the ZnT (SLC30) family that functions to reduce cytoplasmic zinc concentrations and the ZIP (SLC39) family that functions to increase cytoplasmic zinc concentrations. Fluctuations in intracellular zinc levels mediated by these transporter families affect signaling pathways involved in normal cell development, growth, differentiation and death. Consequently, changes in zinc transporter localization and function resulting in zinc dyshomeostasis have pathophysiological effects. Zinc dyshomeostasis has been implicated in the progression of cancer. Here we review recent progress toward understanding the structural basis for zinc transport by ZnT and ZIP family proteins, as well as highlight the roles of zinc as a signaling molecule in physiological conditions and in various cancers. As zinc is emerging as an important signaling molecule in the development and progression of cancer, the ZnT and ZIP transporters that regulate cellular zinc homeostasis are promising candidates for targeted cancer therapy.

Zn 2+ transport across neuronal membranes relies on two classes of transition metal transporters: the ZnT (SLC30) and ZIP (SLC39) families. These proteins function to decrease and increase cytosolic Zn 2+ levels, respectively. Dysfunction of ZnT and ZIP transporters can alter intracellular Zn 2+ levels resulting in deleterious effects. In neurons, imbalances in Zn 2+ levels have been implicated as risk factors in conditions such as Alzheimer’s disease and neurodegeneration, highlighting the pivotal role of Zn 2+ homeostasis in neuropathologies. In addition, Zn 2+ modulates the function of plasma membrane proteins, including ion channels and receptors. Changes in Zn 2+ levels, on both sides of the plasma membrane, profoundly impact signaling pathways governing cell development, differentiation, and survival. This review is focused on recent developments of neuronal Zn 2+ homeostasis, including the impact of Zn 2+ dyshomeostasis in neurological disorders, therapeutic approaches, and the increasingly recognized role of Zn 2+ as a neurotransmitter in the brain.

Channelrhodopsins (ChR) are cation channels that can be expressed heterologously in various living tissues, including cardiac and neuronal cells. To tune spatial and temporal control of potentials across ChR-enriched cell membranes, it is essential to understand how pore hydration impacts the ChR photocycle kinetics. Here, we measure channel opening and closing rates of channelrhodopsin chimera and selected variants (C1C2 wild type, C1C2-N297D, C1C2-N297V, and C1C2-V125L) and correlate them with changes in chemical interactions among functionally important residues in both closed and open states. Kinetic results substantiate that replacement of helices I and II in ChR2 with corresponding residues from ChR1, to make the chimera C1C2, affects the kinetics of channelrhodopsin pore gating significantly, making C1C2 a unique channel. As a prerequisite for studies of ion transport, detailed understanding of the water pathway within a ChR channel is important. Our atomistic simulations confirm that opening of the channel and initial hydration of the previously dry gating regions between helices I, II, III, and VII of the channel occurs with 1) the presence of 13-cis retinal; 2) deprotonation of a glutamic acid gating residue, E129; and 3) subsequent weakening of the central gate hydrogen bond between the same glutamic acid E129 and asparagine N282 in the central region of the pore. Also, an aspartate (D292) is the unambiguous primary proton acceptor for the retinal Schiff base in the hydrated channel.

ABSTRACT The human (h) transporter, hZIP4 is the primary zinc importer in the intestine and is also expressed in a variety of organs such as the pancreas and brain. Dysfunction of hZIP4 can result in the zinc deficiency disease acrodermatitis enteropathica (AE), which disrupts digestive and immune system homeostasis. Structure-function studies of hZIP4 have been greatly hindered by the absence of a robust heterologous expression system. Here, we report the heterologous expression of hZIP4 in Saccharomyces cerevisiae . Both a wild type and a mutant S. cerevisiae strain, in which the endogenous zinc transporters are deleted, were used to test the expression and localization of an hZIP4-GFP fusion protein. A full-length hZIP4-GFP and a truncated membrane domain only (mhZIP4-GFP) protein were successfully produced and targeted to the plasma membrane in yeast.

Cation conducting channelrhodopsins (ChRs) are a popular tool used in optogenetics to control the activity of excitable cells and tissues using light. ChRs with altered ion selectivity are in high demand for use in different cell types and for other specialized applications. However, a detailed mechanism of ion permeation in ChRs is not fully resolved. Here, we use complementary experimental and computational methods to uncover the mechanisms of cation transport and valence selectivity through the channelrhodopsin chimera, C1C2, in the high- and low-conducting open states. Electrophysiology measurements identified a single-residue substitution within the central gate, N297D, that increased Ca 2+ permeability vs. Na + by nearly two-fold at peak current, but less so at stationary current. We then developed molecular models of dimeric wild-type C1C2 and N297D mutant channels in both open states and calculated the PMF profiles for Na + and Ca 2+ permeation through each protein using well-tempered/multiple-walker metadynamics. Results of these studies agree well with experimental measurements and demonstrate that the pore entrance on the extracellular side differs from original predictions and is actually located in a gap between helices I and II. Cation transport occurs via a relay mechanism where cations are passed between flexible carboxylate sidechains lining the full length of the pore by sidechain swinging, like a monkey swinging on vines. In the mutant channel, residue D297 enhances Ca 2+ permeability by mediating the handoff between the central and cytosolic binding sites via direct coordination and sidechain swinging. We also found that altered cation binding affinities at both the extracellular entrance and central binding sites underly the distinct transport properties of the low-conducting open state. This work significantly advances our understanding of ion selectivity and permeation in cation channelrhodopsins and provides the insights needed for successful development of new ion-selective optogenetic tools.