Abstract The Tuberous Sclerosis Complex (TSC) protein complex (TSCC), comprising TSC1, TSC2, and TBC1D7, is widely recognised as a key integration hub for cell growth and intracellular stress signals upstream of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1). The TSCC negatively regulates mTORC1 by acting as a GTPase-activating protein (GAP) towards the small GTPase Rheb. Both human TSC1 and TSC2 are important tumour suppressors, and mutations in them underlie the disease tuberous sclerosis. We used single-particle cryo-EM to reveal the organisation and architecture of the complete human TSCC. We show that TSCC forms an elongated scorpion-like structure, consisting of a central “body”, with a “pincer” and a “tail” at the respective ends. The “body” is composed of a flexible TSC2 HEAT repeat dimer, along the inner surface of which runs the TSC1 coiled-coil backbone, breaking the symmetry of the dimer. Each end of the body is structurally distinct, representing the N- and C-termini of TSC1; a “pincer” is formed by the highly flexible N-terminal TSC1 core domains and a barbed “tail” makes up the TSC1 coiled-coil-TBC1D7 junction. The TSC2 GAP domain is found abutting the centre of the body on each side of the dimerisation interface, poised to bind a pair of Rheb molecules at a similar separation to the pair in activated mTORC1. Our architectural dissection reveals the mode of association and topology of the complex, casts light on the recruitment of Rheb to the TSCC, and also hints at functional higher order oligomerisation, which has previously been predicted to be important for Rheb-signalling suppression.

Abstract While cryo-EM with modern direct electron detectors has proven incredibly powerful, becoming a dominant technique in structural biology, the analysis of cryo-EM images is significantly complicated by their exceptionally low signal-to-noise ratio, limiting the accuracy of the parameterisation of the physical models required for successful classification and reconstruction. Micrographs from modern direct electron detectors are typically collected as dose-fractionated multi-frame movies to allow the recording of separated individual electron impacts. These detectors improve electron detection and allow for both inter-frame motion correction, and dose-dependent image filtering, lessening the overall impact of effects deleterious to the recovery of high-resolution information. In this study we measured the information content at each spatial frequency in cryo-EM movies as it accrues during the course of an exposure. We show that, as well as correction for motion and radiation damage, the use of the information within movies allows substantially improved direct estimation of the remaining key image parameters required for accurate 3D reconstruction: the image CTF and spectral SNR. We are developing “CARYON” {insert contrived acronym here}, as a LAFTER -family filter for cryo-EM movies based upon such measurements. CARYON is intended to provide the best parameter estimation and filtration possible for a single complete, or large sub-section from a, movie micrograph without the use of a previously refined density. We demonstrate its utility in both single-particle and tomographic cryo-EM data processing.

Abstract Bacteriophage ΦKZ is the founding member of a family of massive bacterial viruses. It is considered to have therapeutic potential as its host, Pseudomonas aeruginosa , is an opportunistic, intrinsically antibiotic resistant, pathogen that kills tens of thousands worldwide each year. ΦKZ is an incredibly interesting virus, expressing many systems the host already possesses. On infection, it forms a “nucleus”, erecting a barrier around its massive genome to exclude host restriction endonucleases and CRISPR-Cas systems. ΦKZ infection is independent of the host transcriptional apparatus. It expresses two different multi-subunit RNA polymerases (RNAPs): the virion RNAP (vRNAP) is injected with the viral DNA during infection to transcribe early genes, including those encoding the non-virion RNAP (nvRNAP), which transcribes all further genes. ΦKZ nvRNAP is formed by four polypeptides thought to represent homologues of the eubacterial β/β′ subunits, and a fifth with unclear homology, but essential for transcription. We have resolved the structure of ΦKZ nvRNAP to 3.3 Å, shedding light on its assembly, homology, and the biological role of the fifth subunit: it is an embedded, integral member of the complex, with structural homology and a biochemical role implying that it has evolved from an ancestral homologue to σ-factor.

Bacteriophage ΦKZ (PhiKZ) is the founding member of a family of giant bacterial viruses. It has potential as a therapeutic as its host, Pseudomonas aeruginosa, kills tens of thousands of people worldwide each year. ΦKZ infection is independent of the host transcriptional apparatus; the virus forms a "nucleus", producing a proteinaceous barrier around the ΦKZ genome that excludes the host immune systems. It expresses its own non-canonical multi-subunit non-virion RNA polymerase (nvRNAP), which is imported into its "nucleus" to transcribe viral genes. The ΦKZ nvRNAP is formed by four polypeptides representing homologues of the eubacterial β/β′ subunits, and a fifth that is likely to have evolved from an ancestral homologue to σ-factor. We have resolved the structure of the ΦKZ nvRNAP initiating transcription from its cognate promoter, p119L, including previously disordered regions. Our results shed light on the similarities and differences between ΦKZ nvRNAP mechanisms of transcription and those of canonical eubacterial RNAPs and the related non-canonical nvRNAP of bacteriophage AR9.

R-Smads are effectors of the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily and along with Smad4 form trimers to interact with other transcription factors and with DNA. The 5GC-DNA complexes determined here by X-ray crystallography for Smad5 and Smad8 proteins corroborate that all MH1 domains bind SBE and 5GC sites similarly, although Smad2/3/4 MH1 domains bind DNA as monomers whereas Smad1/5/8 form helix-swapped dimers. To examine the relevance of the dimerization phenomenon and to exclude a possible crystallography-induced dimeric state, we studied these MH1 domains in solution. The results show that Smad5/8 domains populate dimers and open monomers in equilibrium, whereas their Smad2/3/4 counterparts adopt monomeric closed conformations. We also found that swapping the loop1 sequence between Smad5 and Smad3 results in the Smad5 chimera-DNA complex crystallizing as a monomer, revealing that the loop1 sequence determines the monomer/dimer propensity of Smad MH1-domains. We propose that distinct MH1-dimerization status of TGFβ and BMP activated Smads influences the interaction with specific loci genome-wide by distinct R-Smad and Smad4 complexes.Significance TGFβ- and BMP-activated R-Smads were believed to have different preferences with respect to the recognition of DNA motifs and to respond to specific activation inputs. However, recent results indicate that several types of R-Smads can be activated by similar receptors and that all Smads might recognize various DNA motifs. These results pose new questions as to why different types of R-Smads have been conserved for more than 500 million years if they could have a redundant function. They also raise questions as to how different Smad complexes recognize specific clusters of DNA motifs genome-wide.Here, using structural biology approaches, we elucidated some of the rules that help define the dimers of Smad-DNA complexes and propose how dimers and monomers could influence the composition of Smad complexes as well as the recognition of specific cis -regulatory elements genome-wide.Highlights R-Smads and Smad4 interact with 5GC and GTCT sites using a conserved binding mode.Functional differences of TGFβ- and BMP-activated R-Smads are not exclusively related to DNA specificity.Dimer/monomer propensities are detected in solution and in the absence of DNA.Footnotes Supplemental information is available for this article.