Nitric oxide, NO, which is generated by various components of the immune system, has been presumed to be cytotoxic. However, NO has been proposed to be protective against cellular damage resulting during ischemia reperfusion. Along with NO there is often concomitant formation of superoxide/hydrogen peroxide, and hence a synergistic relationship between the cytotoxic effects of nitric oxide and these active oxygen species is frequently assumed. To study more carefully the potential synergy between NO and active oxygen species in mammalian cell cytotoxicity, we utilized either hypoxanthine/xanthine cell cytotoxicity, we utilized either hypoxanthine/xanthine oxidase (a system that generates superoxide/hydrogen peroxide) or hydrogen peroxide itself. NO generation was accomplished by the use of a class of compounds known as "NONOates," which release NO at ambient temperatures without the requirement of enzyme activation or biotransformation. When Chinese hamster lung fibroblasts (V79 cells) were exposed to hypoxanthine/xanthine oxidase for various times or increasing amounts of hydrogen peroxide, there was a dose-dependent decrease in survival of V79 cells as measured by clonogenic assays. However, in the presence of NO released from (C2H5)2N[N(O)NO]-Na+ (DEA/NO), the cytotoxicity resulting from superoxide or hydrogen peroxide was markedly abrogated. Similarly, primary cultures of rat mesencephalic dopaminergic cells exposed either to hydrogen peroxide or to hypoxanthine/xanthine oxidase resulted in the degradation of the dopamine uptake and release mechanism. As was observed in the case of the V79 cells, the presence of NO essentially abrogated this peroxide-mediated cytotoxic effect on mesencephalic cells.

Abstract Immune checkpoint inhibitors have become a standard therapy for several cancers; however, the response is inconsistent and a method for non-invasive assessment has not been established to date. To investigate the capability of multi-modal imaging to evaluate treatment response to immune checkpoint blockade therapy, we employed hyperpolarized 13 C MRI on tumor bearing mice using [1- 13 C] pyruvate and [1,4- 13 C 2 ] fumarate to detect early changes in tumor glycolysis and necrosis, respectively. Following αPD-L1 Ab + αCTLA-4 Ab dual immune checkpoint blockade (ICB) therapy, dynamic contrast enhanced (DCE) MRI was used to determine the treatment effect on intratumor perfusion/permeability. Mice bearing MC38 colon adenocarcinoma and B16.F10 melanoma were used as sensitive and less sensitive models, respectively to immune checkpoint dual blockade of PD-L1 and CTLA-4. Glycolytic flux significantly decreased upon treatment in the less ICB sensitive B16.F10 model but remained essentially unchanged in MC38 tumors. Imaging [1,4- 13 C] fumarate conversion to [1,4- 13 C] malate showed a significant increase in necrosis in the treatment group for the ICB sensitive MC38 tumor ( p = 0.0003), with essentially no change in ICB sensitive B16.F10 tumors. Histological assessment showed increased necrotic tissue with enhanced lymphocyte infiltration in the MC38 treatment group, suggesting immunogenic tumor cell death. Dynamic contrast enhanced MRI showed significantly increased perfusion/permeability of Gd-DTPA in MC38 treated tumor, while a similar trend but statistically non-significant change was observed in B16.F10 treated tumor. These results provide imaging biomarkers to detect early response to cancer immunotherapy, allowing qualitative assessment of tumors treated with immune checkpoint blockade therapy.

Human papillomavirus (HPV) 16 displays substantial sequence variation; four HPV16 lineages (A, B, C, D) have been described, as well as multiple sub-lineages. To identify molecular events associated with HPV16 carcinogenesis we evaluated viral variation, the integration of HPV16, and somatic mutation in 96 cervical cancer samples from Guatemala. A total of 64% (60/94) of the samples had integrated HPV16 sequences, and integration was associated with an earlier age of diagnosis (P=0.0007) and pre-menopausal disease. HPV16 integration sites were broadly distributed in the genome but in one tumor, HPV16 integrated into the promoter of the interferon regulatory factor 4 (IRF4) gene, which plays an important role in the regulation of the interferon response to viral infection. The HPV16 D2 and D3 sub-lineages were found in 23% and 30% of the tumors, respectively and were significantly associated with adenocarcinoma. D2-positive tumors had a higher rate of integration (P=0.011), earlier age of diagnosis (P=0.012), and a lower rate of somatic mutation (P=0.03). Whereas D3-positive tumors are less likely to integrate, have later age-of-diagnosis, and a higher rate of somatic mutation. In conclusion, Guatemalan cervical tumors have a high frequency of the very high-risk HPV16 D2 and D3 sub-lineages and cervical cancer patients with these variants of HPV16 differ in histology, age-of-diagnosis, integration, and somatic mutation frequency. In summary, related lineages of HPV16 have different features of oncogenicity.