Antibiotic administration is the standard treatment for the bacterium Helicobacter pylori, the main causative agent of peptic ulcer disease and gastric cancer. However, the long-term consequences of this treatment on the human indigenous microbiota are relatively unexplored. Here we studied short- and long-term effects of clarithromycin and metronidazole treatment, a commonly used therapy regimen against H. pylori, on the indigenous microbiota in the throat and in the lower intestine. The bacterial compositions in samples collected over a four-year period were monitored by analyzing the 16S rRNA gene using 454-based pyrosequencing and terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). While the microbial communities of untreated control subjects were relatively stable over time, dramatic shifts were observed one week after antibiotic treatment with reduced bacterial diversity in all treated subjects in both locations. While the microbiota of the different subjects responded uniquely to the antibiotic treatment some general trends could be observed; such as a dramatic decline in Actinobacteria in both throat and feces immediately after treatment. Although the diversity of the microbiota subsequently recovered to resemble the pre treatment states, the microbiota remained perturbed in some cases for up to four years post treatment. In addition, four years after treatment high levels of the macrolide resistance gene erm(B) were found, indicating that antibiotic resistance, once selected for, can persist for longer periods of time than previously recognized. This highlights the importance of a restrictive antibiotic usage in order to prevent subsequent treatment failure and potential spread of antibiotic resistance.

Humans host complex microbial communities believed to contribute to health maintenance and, when in imbalance, to the development of diseases. Determining the microbial composition in patients and healthy controls may thus provide novel therapeutic targets. For this purpose, high-throughput, cost-effective methods for microbiota characterization are needed. We have employed 454-pyrosequencing of a hyper-variable region of the 16S rRNA gene in combination with sample-specific barcode sequences which enables parallel in-depth analysis of hundreds of samples with limited sample processing. In silico modeling demonstrated that the method correctly describes microbial communities down to phylotypes below the genus level. Here we applied the technique to analyze microbial communities in throat, stomach and fecal samples. Our results demonstrate the applicability of barcoded pyrosequencing as a high-throughput method for comparative microbial ecology.

Objective

 The early intestinal microbiota exerts important stimuli for immune development, and a reduced microbial exposure as well as caesarean section (CS) has been associated with the development of allergic disease. Here we address how microbiota development in infants is affected by mode of delivery, and relate differences in colonisation patterns to the maturation of a balanced Th1/Th2 immune response. 

Design

 The postnatal intestinal colonisation pattern was investigated in 24 infants, born vaginally (15) or by CS (nine). The intestinal microbiota were characterised using pyrosequencing of 16S rRNA genes at 1 week and 1, 3, 6, 12 and 24 months after birth. Venous blood levels of Th1- and Th2-associated chemokines were measured at 6, 12 and 24 months. 

Results

 Infants born through CS had lower total microbiota diversity during the first 2 years of life. CS delivered infants also had a lower abundance and diversity of the Bacteroidetes phylum and were less often colonised with the Bacteroidetes phylum. Infants born through CS had significantly lower levels of the Th1-associated chemokines CXCL10 and CXCL11 in blood. 

Conclusions

 CS was associated with a lower total microbial diversity, delayed colonisation of the Bacteroidetes phylum and reduced Th1 responses during the first 2 years of life.

BackgroundIt is debated whether a low total diversity of the gut microbiota in early childhood is more important than an altered prevalence of particular bacterial species for the increasing incidence of allergic disease. The advent of powerful, cultivation-free molecular methods makes it possible to characterize the total microbiome down to the genus level in large cohorts.ObjectiveWe sought to assess microbial diversity and characterize the dominant bacteria in stool during the first year of life in relation to atopic eczema development.MethodsMicrobial diversity and composition were analyzed with barcoded 16S rDNA 454-pyrosequencing in stool samples at 1 week, 1 month, and 12 months of age in 20 infants with IgE-associated eczema and 20 infants without any allergic manifestation until 2 years of age (ClinicalTrials.gov ID NCT01285830).ResultsInfants with IgE-associated eczema had a lower diversity of the total microbiota at 1 month (P = .004) and a lower diversity of the bacterial phylum Bacteroidetes and the genus Bacteroides at 1 month (P = .02 and P = .01) and the phylum Proteobacteria at 12 months of age (P = .02). The microbiota was less uniform at 1 month than at 12 months of age, with a high interindividual variability. At 12 months, when the microbiota had stabilized, Proteobacteria, comprising gram-negative organisms, were more abundant in infants without allergic manifestation (Empirical Analysis of Digital Gene Expression in R [edgeR] test: P = .008, q = 0.02).ConclusionLow intestinal microbial diversity during the first month of life was associated with subsequent atopic eczema. It is debated whether a low total diversity of the gut microbiota in early childhood is more important than an altered prevalence of particular bacterial species for the increasing incidence of allergic disease. The advent of powerful, cultivation-free molecular methods makes it possible to characterize the total microbiome down to the genus level in large cohorts. We sought to assess microbial diversity and characterize the dominant bacteria in stool during the first year of life in relation to atopic eczema development. Microbial diversity and composition were analyzed with barcoded 16S rDNA 454-pyrosequencing in stool samples at 1 week, 1 month, and 12 months of age in 20 infants with IgE-associated eczema and 20 infants without any allergic manifestation until 2 years of age (ClinicalTrials.gov ID NCT01285830). Infants with IgE-associated eczema had a lower diversity of the total microbiota at 1 month (P = .004) and a lower diversity of the bacterial phylum Bacteroidetes and the genus Bacteroides at 1 month (P = .02 and P = .01) and the phylum Proteobacteria at 12 months of age (P = .02). The microbiota was less uniform at 1 month than at 12 months of age, with a high interindividual variability. At 12 months, when the microbiota had stabilized, Proteobacteria, comprising gram-negative organisms, were more abundant in infants without allergic manifestation (Empirical Analysis of Digital Gene Expression in R [edgeR] test: P = .008, q = 0.02). Low intestinal microbial diversity during the first month of life was associated with subsequent atopic eczema.

Summary Background Low total diversity of the gut microbiota during the first year of life is associated with allergic diseases in infancy, but little is known how early microbial diversity is related to allergic disease later in school age. Objective To assess microbial diversity and characterize the dominant bacteria in stool during the first year of life in relation to the prevalence of different allergic diseases in school age, such as asthma, allergic rhinoconjunctivitis ( ARC ) and eczema. Methods The microbial diversity and composition was analysed with barcoded 16S rDNA 454 pyrosequencing in stool samples at 1 week, 1 month and 12 months of age in 47 infants which were subsequently assessed for allergic disease and skin prick test reactivity at 7 years of age (ClinicalTrials.gov ID NCT01285830). Results Children developing asthma ( n = 8) had a lower diversity of the total microbiota than non‐asthmatic children at 1 week ( P = 0.04) and 1 month ( P = 0.003) of age, whereas allergic rhinoconjunctivitis ( n = 13), eczema ( n = 12) and positive skin prick reactivity ( n = 14) at 7 years of age did not associate with the gut microbiota diversity. Neither was asthma associated with the microbiota composition later in infancy (at 12 months). Children having IgE‐associated eczema in infancy and subsequently developing asthma had lower microbial diversity than those that did not. There were no significant differences, however, in relative abundance of bacterial phyla and genera between children with or without allergic disease. Conclusion and Clinical Relevance Low total diversity of the gut microbiota during the first month of life was associated with asthma but not ARC in children at 7 years of age. Measures affecting microbial colonization of the infant during the first month of life may impact asthma development in childhood.

Scientific Report18 December 2014Open Access Source Data The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier Hedvig E Jakobsson Hedvig E Jakobsson Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Ana M Rodríguez-Piñeiro Ana M Rodríguez-Piñeiro Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author André Schütte André Schütte Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Anna Ermund Anna Ermund Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Preben Boysen Preben Boysen Department of Food Safety and Infection Biology, Faculty of Veterinary Medicine and Biosciences, Norwegian University of Life Sciences, Oslo, Norway Search for more papers by this author Mats Bemark Mats Bemark Department of Microbiology and Immunology, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Department of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Sahlgrenska University Hospital, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Felix Sommer Felix Sommer The Wallenberg Laboratory, Department of Molecular and Clinical Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Fredrik Bäckhed Fredrik Bäckhed The Wallenberg Laboratory, Department of Molecular and Clinical Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Gunnar C Hansson Gunnar C Hansson Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Malin EV Johansson Corresponding Author Malin EV Johansson Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Hedvig E Jakobsson Hedvig E Jakobsson Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Ana M Rodríguez-Piñeiro Ana M Rodríguez-Piñeiro Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author André Schütte André Schütte Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Anna Ermund Anna Ermund Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Preben Boysen Preben Boysen Department of Food Safety and Infection Biology, Faculty of Veterinary Medicine and Biosciences, Norwegian University of Life Sciences, Oslo, Norway Search for more papers by this author Mats Bemark Mats Bemark Department of Microbiology and Immunology, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Department of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Sahlgrenska University Hospital, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Felix Sommer Felix Sommer The Wallenberg Laboratory, Department of Molecular and Clinical Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Fredrik Bäckhed Fredrik Bäckhed The Wallenberg Laboratory, Department of Molecular and Clinical Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Gunnar C Hansson Gunnar C Hansson Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Malin EV Johansson Corresponding Author Malin EV Johansson Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden Search for more papers by this author Author Information Hedvig E Jakobsson1, Ana M Rodríguez-Piñeiro1, André Schütte1, Anna Ermund1, Preben Boysen2, Mats Bemark3,4, Felix Sommer5, Fredrik Bäckhed5, Gunnar C Hansson1 and Malin EV Johansson 1 1Department of Medical Biochemistry, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden 2Department of Food Safety and Infection Biology, Faculty of Veterinary Medicine and Biosciences, Norwegian University of Life Sciences, Oslo, Norway 3Department of Microbiology and Immunology, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden 4Department of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Sahlgrenska University Hospital, Gothenburg, Sweden 5The Wallenberg Laboratory, Department of Molecular and Clinical Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden *Corresponding author. Tel: +46 31 786 3487; E-mail: [email protected] EMBO Reports (2015)16:164-177https://doi.org/10.15252/embr.201439263 See also: H Li et al (February 2015) PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Two C57BL/6 mice colonies maintained in two rooms of the same specific pathogen-free (SPF) facility were found to have different gut microbiota and a mucus phenotype that was specific for each colony. The thickness and growth of the colon mucus were similar in the two colonies. However, one colony had mucus that was impenetrable to bacteria or beads the size of bacteria—which is comparable to what we observed in free-living wild mice—whereas the other colony had an inner mucus layer penetrable to bacteria and beads. The different properties of the mucus depended on the microbiota, as they were transmissible by transfer of caecal microbiota to germ-free mice. Mice with an impenetrable mucus layer had increased amounts of Erysipelotrichi, whereas mice with a penetrable mucus layer had higher levels of Proteobacteria and TM7 bacteria in the distal colon mucus. Thus, our study shows that bacteria and their community structure affect mucus barrier properties in ways that can have implications for health and disease. It also highlights that genetically identical animals housed in the same facility can have rather distinct microbiotas and barrier structures. Synopsis Mice of the same strain living in the same animal facility can have distinct microbiotas, which affects the penetrability of the colon mucus barrier in a transmissible manner. Free-living mice have impenetrable mucus, as one of the experimental groups. The colon microbiota influences the penetrability of the inner mucus layer. Certain bacteria are associated with a more penetrable inner mucus layer. The mucus phenotype was transmissible by transfer of the microbiota to germ-free mice. Introduction The distal small intestine and the large intestine are the reservoirs for an enormous and complex community of micro-organisms, the gut microbiota. The density of intestinal microbes forms a gradient along the intestine with few bacteria in the upper small intestine and up to 1012 bacteria per gram of faeces in distal colon 1. The microbiota is diverse and typically made up of in total 500–1,000 species with at least 160 species that are shared among individuals with two phyla, the Bacteroidetes and Firmicutes being dominant 23. Less abundant phyla are Proteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria, Fusobacteria and Cyanobacteria. We have co-evolved with our microbiota and developed a finely tuned co-existence, with mutual benefits and ways to avoid harmful effects on the host. The microbiota, for example, aids in food digestion and development of the immune system 4. Together with the mucus layers, a stable microbiota prevents pathogenic bacteria from establishing host infections 56. Mucus covers the intestinal epithelium, but the principle of this mucus protection is solved differently along the intestinal tract 7. The mucus in the small intestine fills up the space between the villi and covers these, but is not attached to the epithelium and has a structure that can allow particles as large as bacteria to penetrate 8. The mucus protection in this site acts as a diffusion barrier with a high concentration of antibacterial products close to the epithelium and few bacteria reaching near the cell surface 910. The small intestinal mucus not only excludes the microbiota, but is also important for immune system development 111213. The higher bacterial load in colon and the slow transit time requires a different protective strategy. Here, mucus forms a physical barrier separating bacteria from the host, which is especially important and developed in the distal colon. The secreted mucus in distal colon forms a stratified inner layer of mucus that is able to keep the bacteria at a distance (> 50 μm in mice, > 200 μm in human) from the epithelium 1415. The mucus is structurally built around the MUC2 mucin that after secretion from the goblet cell expands dramatically and forms sheets of MUC2 networks that stack and form the stratified mucus layer 16. Failure of this protective barrier to separate bacteria from the epithelium is observed in a number of murine colitis models 1517. Muc2-deficient mice totally lack a protective inner mucus layer and have direct contact of bacteria with the epithelium and these mice develop severe colitis 14. Mice with mutations in the Muc2 gene also spontaneously develop inflammation 18. Deficiencies in decorating the mucus with O-glycans cause a faster degradation of the Muc2 mucin network resulting in increased bacterial contact with the cell surface and development of spontaneous colitis 19. The mucus protection system observed in mouse is also present in human colon where an even thicker inner mucus layer separates bacteria from the tissue 15. Ulcerative colitis (UC) patients with active disease have bacteria in contact with the epithelium, whereas patients with UC in remission show a more mixed picture 15. The possibility that the microbiota stimulates the host to develop a mucus layer with improved protective properties has not been explored. We have studied the colon mucus barrier in different wild-type C57BL/6 mouse colonies housed and bred separately in the same specific pathogen-free (SPF) mouse facility. The mucus phenotypes were compared with wild normally free-living mice caught in their natural habitat to elucidate the protective properties of natural occurring mucus. The bacterial composition in the two mouse colonies was analysed by 16S rRNA gene sequencing, which revealed specific bacterial compositions in the two colonies. Bacterial transmission of the mucus phenotypes was shown by colonizing germ-free animals with the flora from the two colonies. Results Bacterial composition in the two husbandries In the same SPF animal facility, two different C57BL/6 colonies have been bred in different rooms. These two C57BL/6 colonies were named as Room 1 and Room 2, where our previous results on mucus properties have been based on the strain in Room 1, which was derived from Taconic 14. The two colonies were maintained on different diets with different composition, but we controlled for the impact of diet, at least within one generation of offspring, by feeding the mice in the two colonies the same chow (Food A, standard chow or Food B, autoclaved chow) from weaning. On Food A, the mice bred in Room 1 were significantly heavier compared to mice bred in Room 2 (P = 0.022, Supplementary Fig S1A). The stool of mice fed Food A was hard and formed distinct pellets, while the stool in animals fed Food B had a looser consistency and did not form hard pellets. The microbiota composition of mice in the two rooms was analysed by 16S rRNA gene sequencing of bacteria in the lumen of ileum, distal colon (called lumen) and caecum as well as bound to the mucus on the tissue after washing the ileum and distal colon (called mucus). The sequencing data have been deposited to the European Nucleotide Archive (ENA) with accession number PRJEB7982. The mucus bacteria thus reflected the bacteria either attached to the outer border of the inner colon mucus layer, within the inner colon mucus in colon, or attached to the epithelial cells of the small intestine. Analysing the data using QIIME revealed that the microbiota differed between Room 1 and Room 2. Principal Coordinates Unweighted UniFrac analysis 20 showed separation of ileum and colon samples along the first component, whereas the two rooms clearly separated along PC2 on Food A (Fig 1A and B). The difference remained also when mice were given Food B (Supplementary Fig S1). When bacterial diversity was studied (Supplementary Figs S2 and S3), the ileum showed the lowest diversity and the distal colon the highest. The microbiota throughout the gut thus clearly differed between the two colonies housed in adjacent rooms in the same animal facility. Figure 1. Microbiota composition in the two mouse colonies Unweighted UniFrac-based PCoA plot of gut microbial communities from mice in Room 1 (red) and Room 2 (blue) at all intestinal locations. Unweighted UniFrac-based PCoA plot of mice gut microbial communities from both rooms at different gut segments; ileum lumen (blue), ileum mucus (yellow), distal colon lumen (red), distal colon mucus (green) and caecum (brown) (data as in A). The relative abundance (%) of the phylum TM7 in ileum lumen Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), ileum mucus Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), distal colon lumen Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), distal colon mucus Room 1 (n = 9) and Room 2 (n = 7), and caecum Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11). The relative abundance (%) of the phylum Proteobacteria (beta and epsilon) in distal colon lumen and mucus in Room 1 (n = 11 in lumen and n = 9 in mucus) and Room 2 (n = 11 in lumen and n = 7 in mucus). Class level microbiota composition in mice from Room 1 and Room 2. The mean relative abundance (%) of the most abundant bacterial classes in ileum lumen Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), ileum mucus Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), distal colon lumen Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), distal colon mucus Room 1 (n = 9) and Room 2 (n = 7), and caecum Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11). Classes represented as less than 1%: Other, DA052, Actinobacteria, Coriobacteriia, Cytophagia, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, (Saprospirae), 4C0d-2, Chloroplast, Deferribacteres, ZB2, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria, TM7-3, Mollicutes, Verrucomicrobiae. Data information: In (C) and (D), data are presented as mean ± SD. Wilcoxon's rank-sum test was conducted to compare over- or under-representation of the phylum. To correct for multiple testing, the P-values were converted to false discovery rate values (Q-values). *P < 0.001, Q < 0.001, **P < 0.001, Q < 0.01. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 1 [embr201439263-SourceData-Fig1.xlsx] Download figure Download PowerPoint The different microbiota was reflected in significant differences at multiple taxonomical levels (Table 1). However, the relative amounts of the dominant phyla (Firmicutes and Bacteroidetes) did not significantly differ between the two rooms at any location throughout the gut (Supplementary Fig S4, Table 1). The major difference between the lumen- and mucus-associated microbiota was found in the distal colon where the phyla Deferribacteres had higher abundance in both rooms (Supplementary Fig S4, Table 1). Table 1. The mean of the relative abundance of dominant phyla, classes and genera in ileum, distal colon, and caecum samples obtained from mice bred in Room 1 or Room 2 Ileum lumen Ileum mucus Distal colon lumen Distal colon mucus Caecum Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 n = 11 n = 11 n = 11 n = 11 n = 11 n = 11 n = 9 n = 7 n = 11 n = 11 mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) mean % (SD) Firmicutes 88 (6) 92 (6) 81 (9) 88 (9) 80 (10) 71 (8) 73 (11) 62 (24) 85 (3) 83 (3) Bacilli 50 (19) 76 (15) 50 (23) 38 (24) 28 (12) 34 (19) 15 (11) 17 (14) 12 (5) 7 (4) Lactobacillus 50 (19) 75 (15) 50 (21) 38 (24) 27 (12) 34 (19) 15 (11) 16 (9) 12 (5) 7 (4) Clostridia 2 (1) 11 (11) 15 (23)** 47 (28)** 30 (20) 35 (22) 50 (22) 45 (28) 64 (11)** 75 (5)** Unknown genus (family unknown) < 1 < 1 1 (2) < 1 10 (9) 12 (14) 18 (10) 16 (17) 27 (13) 29 (19) Other < 1 < 1 2 (4) < 1 10 (8) 9 (6) 18 (11) 13 (14) 21 (7) 19 (16) Ruminococcus 0.1 (0.01)*** 0.3 (0.2)*** < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 0.7 (0.3)*** 1 (1)*** Candidatus arthromitus (Segmented filamentous bacteria) 0.04 (0.12)*** 1 (2)*** 11 (23) 43 (29) 0.01 (0.02)*** 0.2 (0.3)*** 0.03 (0.1)*** 1 (1)*** < 1 < 1 Anaerostipes 0.06 (0.05)** –** 0.2 (0.2)** –** 2 (2)** < 1** 0.8 (0.8)*** –*** 0.8 (0.6)** –** Dehalobacterium < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 0.2 (0.1)** 0.6 (0.2)** Erysipelotrichi 36 (16)* 5 (6)* 17 (13)** 3 (3)** 22 (14)* 2 (2)* 8 (7) 1 (1) 9 (7)* 0.6 (0.7)* Allobaculum 35 (17)** 5 (6)** 15 (13) 3 (3) 22 (14)** 2 (2)** 7 (7) 1 (1) 9 (7)** 0.4 (0.4)** Other 1 (1)** –** < 1 < 1 0.5 (0.8)*** 0.003 (0.01)*** 0.2 (0.3)*** –*** 0.2 (0.2)** –** Bacteroidetes 11 (6) 6 (5) 18 (9) 10 (8) 19 (10) 27 (8) 12 (6) 17 (14) 13 (4) 13 (3) Bacteroidia 11 (5) 6 (5) 18 (9) 10 (8) 19 (10) 27 (8) 12 (6) 17 (14) 13 (4) 13 (3) Unknown genus (family S24-7) 11 (6)** 6 (5)** 16 (10) 10 (8) 15 (9) 14 (6) 9 (5) 10 (10) 8 (2)** 5 (1)** Bacteroides < 1 < 1 < 1 < 1 0.4 (0.4)** 4 (3)** < 1 3 (2) 0.4 (0.2)** 2 (1)** Parabacteroides < 1 < 1 < 1 < 1 0.3 (0.3)** 4 (4)** < 1 2 (2) 0.3 (0.2)** 2 (2)** Prevotella – < 1 < 1 – 0.01 (0.01)** 0.3 (0.4)** < 1 < 1 –** 0.1 (0.1)** Odoribacter – – < 1 – < 1 < 1 < 1 < 1 0.4 (0.3)** 0.6 (0.5)** Proteobacteria 0.1 (0.1)* 1 (1)* < 1 1 (1) < 1 1 (2) 3 (3) 10 (16) 0.7 (0.4)*** 2 (2)*** Alphaproteobacteria – < 1 < 1 < 1 – < 1 < 1 1 (2) < 1 < 1 Betaproteobacteria < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 1 (2) 5 (8) 0.2 (0.001)** 0.1 (0.04)** Deltaproteobacteria 0.003 (0.01)* 1 (1)* 0.021 (0.028)* 0.5 (0.5)* < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 Desulfovibrio –** 1 (1)** 0.003 (0.006)** 0.5 (0.5)** –** 0.2 (0.2)** 0.002 (0.005)*** 0.3 (0.2)*** 0.002 (0.005)** 0.6 (0.3)** Epsilonproteobacteria – < 1 – < 1 –* 0.02 (0.1)* < 1 2 (5) –** 2 (2)** Unknown genus (family Helicobacteraceae) – < 1 < 1 < 1 –*** 1 (1)*** 0.002 (0.006) 2 (5) –*** 2 (2)*** Gammaproteobacteria < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 1 (1) < 1 < 1 Actinobacteria < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 0.4 (0.2)** 0.2 (0.1)** TM7 0.002 (0.006)* 0.2 (0.2)* –** 0.12 (0.14)** 0.003 (0.01)* 0.2 (0.1)* < 1 < 1 0.001 (0.003)* 0.2 (0.1)* Deferribacteres < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 11 (11) 9 (10) < 1 < 1 Deferribacteres < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 11 (11) 9 (10) < 1 < 1 Mucispirillum < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 11 (11) 9 (10) < 1 < 1 Statistical tests of over-or under-representation of bacterial lineages among sample groups (Room 1 versus Room 2) at each sample location were made at the phylum (bold), class (bold) and genus levels using Wilcoxon's rank-sum test. To correct for multiple testing, the P-values were converted to false discovery rate values (Q-values). (–) corresponds to no sequences present. For values < 1, the exact value is only given if significantly different. *P-value < 0.001, Q-value < 0.001, **P-value <0.001, Q-value < 0.01, ***P-value < 0.01, Q-value< 0.05. Comparing mice in the two rooms at the class and genus levels revealed pronounced differences (Food A, Figs 1D–E and 2A–F, Table 1). In Room 1, the genus Anaerostipes, within the Clostridia class, was found in significantly higher amounts at all locations throughout the gut (Fig 2A, Table 1). The Erysipelotrichi class was also found in higher abundances at all locations in Room 1 (Fig 1E, Table 1). The dominant genus within this class contributing to this difference was the genus Allobaculum, which was also found in higher relative abundances at all locations and significantly so in the lumen samples (Fig 2B, Table 1). Within the Bacteroidia class, an unknown genus (family S24-7) was found at significantly higher levels in Room 1 in both ileum lumen and caecum (Table 1). Figure 2. Significant genera between the two mouse colonies A–F. The relative abundance (%) of the genera Anaerostipes (A), Allobaculum (B), Desulfovibrio (C), Bacteroides (D), Parabacteroides (E) and Prevotella (F) in ileum lumen Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), ileum mucus Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), distal colon lumen Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11), distal colon mucus Room 1 (n = 9) and Room 2 (n = 7), and caecum Room 1 (n = 11) and Room 2 (n = 11). Data are presented as mean ± SD. Wilcoxon's rank-sum test was conducted to compare over- or under-representation of the different genera. To correct for multiple testing, the P-values were converted to false discovery rate values (Q-values). *P < 0.001, Q < 0.001, **P < 0.001, Q < 0.01, ***P < 0.01, Q < 0.05. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 2 [embr201439263-SourceData-Fig2.xlsx] Download figure Download PowerPoint In Room 2, the phylum TM7 was a small component but had a higher relative abundance at all locations (Fig 1C, Table 1). Proteobacteria was also generally more abundant in Room 2 (Supplementary Fig S4, Table 1). Within this phylum, the classes Betaproteobacteria and Epsilonproteobacteria were found at higher levels in the mucus of mice in Room 2 and Epsilonproteobacteria were significantly more abundant in distal colon lumen and caecum (Fig 1D, Table 1). Within this class, an unknown genus of the Helicobacteraceae family was found at higher levels in Room 2 (Table 1). Within the Deltaproteobacteria, one genus, Desulfovibrio, was found in significantly higher amounts at all locations of mice in Room 2 (Fig 2C, Table 1). The Clostridia class was significantly more abundant in ileum mucus and caecum samples of Room 2 (Fig 1E, Table 1). In ileum mucus, the dominant genus within the Clostridia class was Candidatus arthromitus (segmented filamentous bacteria, SFB), which was also found in higher levels in Room 2 (Table 1). SFB also showed a small but significant difference between the rooms in the distal colon with higher levels in Room 2. Also, within the Bacteroidia class, the genera Bacteroides, Parabacteroides, and Prevotella were found in significantly higher abundances in distal colon lumen and caecum samples in Room 2 (Fig 2D–F, Table 1). The two diets used were tested by analysing animals in both locations also fed with Food B diet (autoclaved). Altering the diet from weaning gave some shift in the microbiota, but less than the difference between the two rooms. All mice on Food B showed higher relative abundances of the phylum Proteobacteria at all locations along the gut and in both rooms with significant differences in ileum lumen, ileum mucus and caecum in Room 1, and in distal colon lumen in both rooms (Supplementary Fig S5, Supplementary Table S1). The phylum TM7 was also found at higher levels at all gut locations and rooms when mice were fed Food B (Supplementary Table S1). The Erysipelotrichi class and the genus Allobaculum was found in higher relative abundances in ileum and distal colon, as well as in caecum when the mice were fed Food B in Room 1 (Supplementary Table S1). It was thus concluded that the two C57BL/6 mice strains bred separately had stable, but different microbiota that were vertically transmitted. Food influenced the microbiota to a small extent. This raised the question of the effect of the different microbiota on the mucus thickness and properties. Differences in the mucus quality in mice from the two husbandries The thickness of the secreted mucus from mice in the two rooms was measured on small intestinal and distal colon explants mounted in a perfusion chamber after visualization of the mucus surface by charcoal 21. The small intestinal mucus is normally easily removed by aspiration, and the thickness was measured before (pre) and after (post) aspiration. No differences were observed between the rooms or diets (Fig 3A). In colon, the mucus forms two layers; an outer non-attached and an inner mucus layer that is firmly attached to the epithelium 14. The thickness of the inner mucus layer as well as the mucus growth did not differ significantly between the two rooms on either food (Fig 3B). Figure 3. Differences in mucus properties in the two mouse colonies and in free-living mice Mucus thickness on explants from distal small intestine (pre) and mucus remaining after aspiration (post) in the different rooms (Room 1 and 2) with the different foods (Food A and Food B). Data are presented as mean ± SEM (n = 3). Mucus thickness measured during one hour on distal colon explants from mice in the two rooms (Room 1 and 2) with different foods (Food A and Food B). The mucus not attached to the epithelium was removed after 60 min and the attached mucus was measured (post). Data are presented as mean ± SEM (n = 3). Penetrability of beads (red 0.5 μm, purple 1 μm, green 2 μm) in mucus on explants from mice housed in Room 1 or Room 2 with either Food A or Food B. The epithelium is stained by Calcein violet (blue). Double arrows indicate impenetrable mucus. Scale bar is 100 μm. The impenetrable mucus as the mean distance of the 20 most penetrable beads shows a significant difference between the mice in the two rooms with Food A. Data are presented as boxplots with median and min–max whiskers. Mann–Whitney U-tests were performed to compare groups (Room 1 and 2) on each food (Food A: n = 5, Food B: n = 3–4, *P = 0.032). Mucus penetrability as in (C) on explants from free-living mice. Double arrow indicates impenetrable mucus. Scale bar is 100 μm. Immunostaining for Muc2 (green) of distal colon sections from free-living mice with Hoechst counterstain (blue). Double arrow indicates inner mucus layer without bacteria (visualized by DNA stain). Scale bar is 50 μm. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 3A, B, D [embr201439263-SourceData-Fig3A-B-D.xlsx] Download figure Download PowerPoint The size exclusion properties of the mucus can be assessed by allowing fluorescent beads, the size of bacteria, to sediment through the mucus formed on colonic explants 15. Using this system, the secreted mucus has previously been shown to separate the beads from the epithelium in both mouse and human biopsies. As shown before, mice from Room 1 secreted mucus that was impenetrable to the beads, whereas the mucus on explants from mice housed in Room 2 was more penetrable (Fig 3C). Mice given food B showed increased penetrability in both groups, but a difference still remained between Room 1 and 2 mice (Fig 3C). The penetrability of beads was estimated as the distance from the epithelium to the 20 closest located beads (Fig 3D). This showed significantly more penetrable mucus with a thinner, impervious part of the inner mucus layer in Room 2. Mice in Room 2 thus differed in mucus properties compared to mice in Room 1 that we had assumed to have a normal mucus layer. This raised doubts on what is a normal mucus layer. To address this, mice caught in their wild habitat were studied with the same methods as for mice from the two rooms. In free-living mice, we could typically observe a non-penetrable inner colon mucus layer that separated the beads from the epithelium even further than what was observed in mice from Room 1 (Fig 3E). Tissue staining of distal colon tissue could also show bacteria well separated from the epithelium (Fig 3F). Thus, free-living mice have mucus that is even better developed, thicker and more stratified with bacteria further separated from the epithelium than in Room 1. Bacteria penetration in mucus and histology of mice in different husbandries Muc2 mucin immunohistochemistry revealed that the mucus in fixed sections looked different in mice from Room 2 on Food A (Fig 4A). When bacteria were localized in relation to the colon mucus using fluorescent in situ hybridization, bacteria penetrated the inner mucus layer at distinct locations. A separation between epithelium and bacteria was observed in other areas and most bacteria were still not in direct contact with the epithelial surface. A good separation of bacteria and epithelium by a stratified inner mucus layer was only present in mice from Room 1 (Fig 4A). The inner mucus layer was after fixation observed to be thinner, and stratification was not evident in sections from animals fed Food B in both rooms, but the difference between the two rooms remained (Fig 4B). Figure 4. Bacteria localization and histology of mice from the two husbandries A, B. Immunostaining of colon sections from mice in the two rooms with Food A (A) or Food B (B) using Anti-MUC2C3 (green) and FISH with a general bacterial 16S rRNA gene probe to detect bacteria (red) counterstained with Hoechst (blue). Double arrows mark the inner mucus layer that separates bacteria from the epithelium. Bacteria are found within the inner mucus layer (indicated by arrows) in mice housed in Room 2. Scale bar is 10 μm. C. Immunostaining of the Muc2 precursor before it gets O-glycosylated using the anti-apoMuc2 antiserum on mice from both rooms fed Food A. Scale bar is 100 μm. D. The crypt length was measured in distal colon on sections from mice in the two rooms on Food A (n = 4) E. The number of goblet cells per crypt was counted in distal colon of mice in the two rooms on Food A (n = 10). F. The numb

The intestinal mucus layer provides a barrier limiting bacterial contact with the underlying epithelium. Mucus structure is shaped by intestinal location and the microbiota. To understand how commensals modulate gut mucus, we examined mucus properties under germ-free (GF) conditions and during microbial colonization. Although the colon mucus organization of GF mice was similar to that of conventionally raised (Convr) mice, the GF inner mucus layer was penetrable to bacteria-sized beads. During colonization, in which GF mice were gavaged with Convr microbiota, the small intestine mucus required 5 weeks to be normally detached and colonic inner mucus 6 weeks to become impenetrable. The composition of the small intestinal microbiota during colonization was similar to Convr donors until 3 weeks, when Bacteroides increased, Firmicutes decreased, and segmented filamentous bacteria became undetectable. These findings highlight the dynamics of mucus layer development and indicate that studies of mature microbe-mucus interactions should be conducted weeks after colonization.

ABSTRACT The taxonomic composition of a microbial community can be deduced by analyzing its rRNA gene content by, e.g., high-throughput DNA sequencing or DNA chips. Such methods typically are based on PCR amplification of rRNA gene sequences using broad-taxonomic-range PCR primers. In these analyses, the use of optimal primers is crucial for achieving an unbiased representation of community composition. Here, we present the computer program DegePrime that, for each position of a multiple sequence alignment, finds a degenerate oligomer of as high coverage as possible and outputs its coverage among taxonomic divisions. We show that our novel heuristic, which we call weighted randomized combination, performs better than previously described algorithms for solving the maximum coverage degenerate primer design problem. We previously used DegePrime to design a broad-taxonomic-range primer pair that targets the bacterial V3-V4 region (341F-805R) (D. P. Herlemann, M. Labrenz, K. Jurgens, S. Bertilsson, J. J. Waniek, and A. F. Andersson, ISME J. 5:1571–1579, 2011, http://dx.doi.org/10.1038/ismej.2011.41 ), and here we use the program to significantly increase the coverage of a primer pair (515F-806R) widely used for Illumina-based surveys of bacterial and archaeal diversity. By comparison with shotgun metagenomics, we show that the primers give an accurate representation of microbial diversity in natural samples.

Infection in the central nervous system is a severe condition associated with high morbidity and mortality. Despite ample testing, the majority of encephalitis and meningitis cases remain undiagnosed. Metagenomic sequencing of cerebrospinal fluid has emerged as an unbiased approach to identify rare microbes and novel pathogens. However, several major hurdles remain, including establishment of individual limits of detection, removal of false positives and implementation of universal controls. Twenty-one cerebrospinal fluid samples, in which a known pathogen had been positively identified by available clinical techniques, were subjected to metagenomic DNA sequencing. Fourteen samples contained minute levels of Epstein-Barr virus. The detection threshold for each sample was calculated by using the total leukocyte content in the sample and environmental contaminants found in the bioinformatic classifiers. Virus sequences were detected in all ten samples, in which more than one read was expected according to the calculations. Conversely, no viral reads were detected in seven out of eight samples, in which less than one read was expected according to the calculations. False positive pathogens of computational or environmental origin were readily identified, by using a commonly available cell control. For bacteria, additional filters including a comparison between classifiers removed the remaining false positives and alleviated pathogen identification. Here we show a generalizable method for identification of pathogen species using DNA metagenomic sequencing. The choice of bioinformatic method mainly affected the efficiency of pathogen identification, but not the sensitivity of detection. Identification of pathogens requires multiple filtering steps including read distribution, sequence diversity and complementary verification of pathogen reads.

Abstract Background Infection in the central nervous system is a severe condition associated with high morbidity and mortality. Despite ample testing, the majority of encephalitis and meningitis cases remain undiagnosed. Metagenomic sequencing of cerebrospinal fluid has emerged as an unbiased approach to identify rare microbes and novel pathogens. However, several major hurdles remains, including establishment of individual limits of detection, removal of false positives and implementation of universal controls. Results Twenty-one cerebrospinal fluid samples, in which a known pathogen had been positively identified by available clinical techniques, were subjected to metagenomic DNA sequencing using massive parallel sequencing. Fourteen samples contained minute levels of Epstein-Barr virus. Calculation of the detection threshold for each sample was made using total leukocyte content in the sample and environmental contaminants found in bioinformatic classifiers. Virus sequences were detected in all ten samples, in which more than one read was expected according to calculations. Conversely, no viral reads were detected in seven out of eight samples, in which less than one read was expected according to calculations. False positive pathogens of computational or environmental origin were readily identified, by using a commonly available cell control. For bacteria additional filters including a comparison between classifiers removed the remaining false positives and alleviated pathogen identification. Conclusions Here we show a generalizable method for detection and identification of pathogen species using metagenomic sequencing. The sensitivity for each sample can be calculated using the leukocyte count and environmental contamination. The choice of bioinformatic method mainly affected the efficiency of pathogen identification, but not the sensitivity of detection. Identification of pathogens require multiple filtering steps including read distribution, sequence diversity and complementary verification of pathogen reads.