In plants, autophagy has been assigned 'pro-death' and 'pro-survival' roles in controlling programmed cell death associated with microbial effector-triggered immunity. The role of autophagy in basal immunity to virulent pathogens has not been addressed systematically, however. Using several autophagy-deficient (atg) genotypes, we determined the function of autophagy in basal plant immunity. Arabidopsis mutants lacking ATG5, ATG10 and ATG18a develop spreading necrosis upon infection with the necrotrophic fungal pathogen, Alternaria brassicicola, which is accompanied by the production of reactive oxygen intermediates and by enhanced hyphal growth. Likewise, treatment with the fungal toxin fumonisin B1 causes spreading lesion formation in atg mutant genotypes. We suggest that autophagy constitutes a 'pro-survival' mechanism that controls the containment of host tissue-destructive microbial infections. In contrast, atg plants do not show spreading necrosis, but exhibit marked resistance against the virulent biotrophic phytopathogen, Pseudomonas syringae pv. tomato. Inducible defenses associated with basal plant immunity, such as callose production or mitogen-activated protein kinase activation, were unaltered in atg genotypes. However, phytohormone analysis revealed that salicylic acid (SA) levels in non-infected and bacteria-infected atg plants were slightly higher than those in Col-0 plants, and were accompanied by elevated SA-dependent gene expression and camalexin production. This suggests that previously undetected moderate infection-induced rises in SA result in measurably enhanced bacterial resistance, and that autophagy negatively controls SA-dependent defenses and basal immunity to bacterial infection. We infer that the way in which autophagy contributes to plant immunity to different pathogens is mechanistically diverse, and thus resembles the complex role of this process in animal innate immunity.

Plants adapt to fluctuating environmental conditions by adjusting their metabolism and gene expression to maintain fitness

ABSTRACT Cu + -chaperones are a diverse group of proteins that allocate Cu + ions to specific copper-proteins, creating different copper pools targeted to specific physiological processes. Symbiotic nitrogen fixation carried out in legume root nodules indirectly requires relatively large amounts of copper e.g. for energy delivery via respiration, for which targeted copper deliver systems would be required. MtNCC1 is a nodule-specific Cu + -chaperone encoded in the Medicago truncatula genome, with a N-terminus Atx1-like domain that can bind Cu + with picomolar affinities. This gene is expressed primarily from the late infection zone to the early fixation zone, and is located in the cytosol, associated to plasma and symbiosome membranes, and within nuclei. Consistent with its key role in nitrogen fixation, ncc1 mutants have a severe reduction of nitrogenase activity, and a 50% reduction in copper-dependent cytochrome c oxidase activity. A subset of the copper-proteome is also affected in the mutant nodules. Many of these proteins can be pulled-down when using a Cu + -loaded N-terminal MtNCC1 moiety as a bait, indicating a role in nodule copper homeostasis and in copper-dependent physiological processes. Overall, these data suggest a pleiotropic role of MtNCC1 in copper delivery for symbiotic nitrogen fixation.

Legumes form a symbiosis with rhizobia that convert atmospheric nitrogen (N2) to ammonia which they provide to the plant in return for a carbon and nutrient supply. Nodules, developed as part of the symbiosis, harbor rhizobia which are enclosed in the plant-derived symbiosome membrane (SM), to form a symbiosome. In the mature nodule all exchanges between the symbionts occur across the SM. Here we characterize GmYSL7, a member of Yellow stripe-like family which is localized to the SM in soybean nodules. It is expressed specifically in nodule infected cells with expression peaking soon after nitrogenase becomes active. Although most members of the family transport metal complexed with phytosiderophores, GmYSL7 does not. It transports oligopeptides of between four and 12 amino acids. Silencing of GmYSL7 reduces nitrogenase activity and blocks development when symbiosomes contain a single bacteroid. RNAseq of nodules in which GmYSL7 is silenced suggests that the plant initiates a defense response against the rhizobia. There is some evidence that metal transport in the nodules is dysregulated, with upregulation of genes encoding ferritin and vacuolar iron transporter family and downregulation of a gene encoding nicotianamine synthase. However, it is not clear whether the changes are a result of the reduction of nitrogen fixation and the requirement to store excess iron or an indication of a role of GmYSL7 in regulation of metal transport in the nodules. Further work to identify the physiological substrate for GmYSL7 will allow clarification of this role.

Yellow Stripe-Like (YSL) proteins are a family of plant transporters typically involved in transition metal homeostasis. The substrate of three of the four YSL clades (clades I, II, and IV) are metal complexes with non-proteinogenic amino acid nicotianamine or its derivatives. No such transport capabilities have been shown for any member of the remaining clade (clade III), which is able to translocate short peptides across the membranes instead. The connection between clade III YSL members and metal homeostasis might have been masked by the functional redundancy characteristic of this family. This might have been circumvented in legumes through neofunctionalization of YSLs to ensure a steady supply of transition metals for symbiotic nitrogen fixation in root nodules. To test this possibility, Medicago truncatula clade III transporter MtYSL7 has been studied both when the plant was fertilized with ammonium nitrate or when nitrogen had to be provided by endosymbiotic rhizobia within the root nodules. MtYSL7 is a plasma membrane protein expressed in the vasculature and in the nodule cortex. This protein is able to transport short peptides into the cytosol, although none with known metal homeostasis roles. Reducing MtYSL7 expression levels resulted in diminished nitrogen fixation rates. In addition, nodules of mutant lines lacking YSL7 accumulated more copper and iron, the later the likely result of increased expression in roots of iron uptake and delivery genes. The available data is indicative of a role of MtYSL7, and likely other clade III YSLs, in transition metal homeostasis.

Symbiotic nitrogen fixation carried out by the interaction between legumes and diazotrophic bacteria known as rhizobia requires of relatively large levels of transition metals. These elements act as cofactors of many key enzymes involved in this process. Metallic micronutrients are obtained from soil by the roots and directed to sink organs by the vasculature, in a process participated by a number of metal transporters and small organic molecules that mediate metal delivery in the plant fluids. Among the later, nicotianamine is one of the most important. Synthesized by nicotianamine synthases (NAS), this non-proteinogenic amino acid forms metal complexes participating in intracellular metal homeostasis and long-distance metal trafficking. Here we characterized the NAS2 gene from model legume Medicago truncatula. MtNAS2 is located in the root vasculature and in all nodule tissues in the infection and fixation zones. Symbiotic nitrogen fixation requires of MtNAS2 function, as indicated by the loss of nitrogenase activity in the insertional mutant nas2-1, a phenotype reverted by reintroduction of a wild-type copy of MtNAS2. This would be the result of the altered iron distribution in nas2-1 nodules, as indicated by X-ray fluorescence studies. Moreover, iron speciation is also affected in these nodules. These data suggest a role of nicotianamine in iron delivery for symbiotic nitrogen fixation.

SUMMARY Zinc is an essential nutrient at low concentrations, but toxic at slightly higher ones. This could be used by plants to fight pathogens colonization. Elemental distribution in Arabidopsis thaliana leaves inoculated with the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina BMM ( PcBMM ) was determined and compared to mock-inoculated ones. Infection assays were carried out in wild type and long-distance zinc trafficking double mutant hma2hma4 , defective in root-to-shoot zinc partitioning. Expression levels of genes involved in zinc homeostasis or in defence phytohormone-mediated pathways were determined. Zinc and manganese levels increased at the infection site. Zinc accumulation was absent in hma2hma4. HMA2 and HMA4 transcription levels were upregulated upon PcBMM inoculation. Consistent with a role of these genes in plant immunity, hma2hma4 mutants were more susceptible to PcBMM infection, phenotype rescued upon zinc supplementation. Transcript levels of genes involved in the salicylic acid, ethylene and jasmonate pathways were constitutively upregulated in hma2hma4 plants. These data are consistent with a role of zinc in plant immunity not only of hyperaccumulator plants, but also of plants containing ordinary levels of zinc. This new layer of immunity seems to run in parallel to the already characterized defence pathways, and its removal has a direct effect on pathogen resistance.

Iron is an essential cofactor for symbiotic nitrogen fixation. It is required by many of the enzymes facilitating the conversion of N2 into NH4+ by endosymbiotic bacteria living within root nodule cells, including signal transduction proteins, O2 homeostasis systems, and nitrogenase itself. Consequently, host plants have developed a transport network to deliver essential iron to nitrogen-fixing nodule cells. Model legume Medicago truncatula Ferroportin2 (MtFPN2) is a nodule-specific gene that encodes an iron-efflux protein. MtFPN2 is located in intracellular membranes in the nodule vasculature, and in the symbiosome membranes that contain the nitrogen-fixing bacteria in the differentiation and early-fixation zones of the nodules. Loss-of-function of MtFPN2 leads to altered iron distribution and speciation in nodules, which causes a reduction in nitrogenase activity and in biomass production. Using promoters with different tissular activity to drive MtFPN2 expression in MtFPN2 mutants, we determined that MtFPN2-facilitated iron delivery across symbiosomes is essential for symbiotic nitrogen fixation, while its presence in the vasculature does not seem to play a major role in in the conditions tested.

- Copper is an essential nutrient for symbiotic nitrogen fixation. This element is delivered by the host plant to the nodule, where membrane copper transporter would introduce it into the cell to synthesize cuproproteins. - COPT family members in model legume Medicago truncatula were identified and their expression determined. Yeast complementation assays, confocal microscopy, and phenotypical characterization of a Tnt1 insertional mutant line were carried out in the nodule-specific M. truncatula COPT family member. - Medicago truncatula genome encodes eight COPT transporters. MtCOPT1 (Medtr4g019870) is the only nodule-specific COPT gene. It is located in the plasma membrane of the differentiation, interzone and early fixation zones. Loss of MtCOPT1 function results in a copper-mitigated reduction of biomass production when the plant obtains its nitrogen exclusively from symbiotic nitrogen fixation. Mutation of MtCOPT1 results in diminished nitrogenase activity in nodules, likely an indirect effect from the loss of a copper-dependent function, such as cytochrome oxidase activity in copt1-1 bacteroids. - These data are consistent with a model in which MtCOPT1 transports copper from the apoplast into nodule cells to provide copper for essential metabolic processes associated with symbiotic nitrogen fixation.

Zinc is a micronutrient required for symbiotic nitrogen fixation. It has been proposed that in model legume Medicago truncatula, zinc is delivered in a similar fashion as iron, i.e. by the root vasculature into the nodule and released in the infection/differentiation zone. There, zinc transporters must introduce this element into rhizobia-infected cells to metallate the apoproteins that use zinc as a cofactor. MtZIP6(Medtr4g083570) is a M. truncatula Zinc-Iron Permease (ZIP) that is expressed only in roots and nodules, with the highest expression levels in the infection/differentiation zone. Immunolocalization studies indicate that it is located in the plasma membrane of rhizobia-infected cells in the nodule. Down-regulating MtZIP6 expression levels with RNAi does not result in any strong phenotype when plants are being watered with mineral nitrogen. However, these silenced plants displayed severe growth defects when they depended on nitrogen fixed by their nodules, as a consequence of the loss of 80% of their nitrogenase activity. The reduction of this activity was not the result of iron not reaching the nodule, but an indirect effect of zinc being retained in the infection/differentiation zone and not reaching the cytosol of rhizobia-infected cells. These data are consistent with a model in which MtZIP6 would be responsible for zinc uptake by rhizobia-infected nodule cells in the infection/differentiation zone.