Abstract We investigated the mechanism of conjugal transfer of the endemic Klebsiella pneumoniae carbapenem resistance plasmid, pKpQIL. Transfer efficiency of this plasmid was found to be dependent on the expression of the major outer membrane porin, OmpK36, in recipient cells. We also found that conjugal uptake is reduced in recipients expressing an OmpK36 isoform associated with the globally pervasive K. pneumoniae ST258 clade (OmpK36 ST258 ). This reduction was attributed to a glycine-aspartate insertion in loop 3 of OmpK36 ST258 , which constricts the pore by 26%. Deletion of finO , which encodes an RNA-binding protein, derepressed transfer of pKpQIL and enabled visualisation of the conjugation pilus and OmpK36-dependent conjugation in real time. While deletion of traN abolished pKpQIL conjugation, substituting traN in pKpQIL with its homologue from R100-1 circumvented OmpK36 dependency. These results suggest that OmpK36 in recipient K. pneumoniae and the pKpQIL-encoded TraN in donor bacteria cooperate to facilitate plasmid transfer. This is the first report since 1998 to suggest a novel recipient cell receptor for IncF plasmid transfer and supports the idea that TraN mediates receptor specificity for plasmids belonging to this incompatibility group.

Chaperone-usher pili are long, polymeric protein fibres displayed on the surface of many bacterial pathogens. These critical virulence factors allow bacteria to specifically attach to host cells during infection. The type 1 and P pili of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) play important roles during UPEC′s colonisation of the urinary tract, mediating bacterial attachment to the bladder and kidney, respectively. Also, their biomechanical properties that allow them to reversibly uncoil in response to flow-induced forces are critical for UPEC′s ability to retain a foothold in the unique and hostile environment of the urinary tract. Here we provide the 4.2 Å resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the type 1 pilus rod, which together with the previous structure of the P pilus rod, enables us to understand the remarkable ″spring-like″ properties of chaperone-usher pili in more detail.

ABSTRACT Genome replication is a fundamental biological activity shared by all organisms. Chromosomal replication proceeds bidirectionally from origins, requiring the loading of two helicases, one for each replisome. The molecular mechanisms for helicase loading at bacterial chromosome origins ( oriC ) are unclear. Here we investigated the essential DNA replication initiation protein DnaD in the model organism Bacillus subtilis. A set of DnaD residues required for ssDNA binding was identified, and photo-crosslinking revealed that this ssDNA binding region interacts preferentially with one strand of oriC. Biochemical and genetic data support the model that DnaD recognizes a new single-stranded DNA (ssDNA) motif located in oriC ( D naD R ecognition E lement, “DRE”). Considered with cryo-electron microscopy (cryo-EM) imaging of full length DnaD, we propose that the location of the DRE within the oriC orchestrates strand-specific recruitment of helicase to achieve bidirectional DNA replication. These findings significantly advance our mechanistic understanding of bidirectional replication from a bacterial chromosome origin.

ABSTRACT The mechanisms responsible for helicase loading during the initiation of chromosome replication in bacteria are unclear. Here we report both a positive and a negative mechanism for directing helicase recruitment in the model organism Bacillus subtilis . Systematic mutagenesis of the essential replication initiation gene dnaD and characterization of DnaD variants revealed protein interfaces required for interacting with the master initiator DnaA and with a specific single-stranded DNA (ssDNA) sequence located in the chromosome origin ( D naD R ecognition E lement, “DRE”). We propose that the location of the DRE within the replication origin orchestrates recruitment of helicase to achieve bidirectional DNA replication. We also report that the developmentally expressed repressor of DNA replication initiation, SirA, acts by blocking the interaction of DnaD with DnaA, thereby inhibiting helicase recruitment to the origin. These findings significantly advance our mechanistic understanding of helicase recruitment and regulation during bacterial DNA replication initiation. Because DnaD is essential for the viability of clinically relevant Gram-positive pathogens, DnaD is an attractive target for drug development.