BackgroundLactobacilli are probiotic bacteria that are frequently tested in the management of allergic diseases or gastroenteritis. It is hypothesized that these probiotics have immunoregulatory properties and promote mucosal tolerance, which is in part mediated by regulatory T cells (Treg cells). On the basis of pathogenic or tissue-specific priming, dendritic cells (DC) acquire different T cell–instructive signals and drive the differentiation of naive TH cells into either TH1, TH2, or regulatory effector T cells.ObjectiveWe studied in what way different species of lactobacilli prime human DCs for their ability to drive Treg cells.MethodsHuman monocyte-derived DCs were cultured in vitro with lactobacilli of different species.ResultsTwo different species of lactobacilli, Lactobacillus reuteri and Lactobacillus casei, but not Lactobacillus plantarum, prime monocyte-derived DCs to drive the development of Treg cells. These Treg cells produced increased levels of IL-10 and were capable of inhibiting the proliferation of bystander T cells in an IL-10–dependent fashion. Strikingly, both L reuteri and L casei, but not L plantarum, bind the C-type lectin DC-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin (DC-SIGN). Blocking antibodies to DC-SIGN inhibited the induction of the Treg cells by these probiotic bacteria, stressing that ligation of DC-SIGN can actively prime DCs to induce Treg cells.ConclusionsThe targeting of DC-SIGN by certain probiotic bacteria might explain their beneficial effect in the treatment of a number of inflammatory diseases, including atopic dermatitis and Crohn's disease.

Background Most of the effort directed at understanding the role infections have in preventing allergy has focused on bacteria and viruses and their ability to divert the immune system towards T-helper-1 responses and away from proallergic T-helper-2 responses. However, helminth infections, highly prevalent in large parts of the developing world, where allergy is uncommon, stimulate strong T-helper-2 responses. We investigated the influence of chronic helminth infections on the prevalence of atopy and aimed to understand the relation at a detailed immunological level. Methods 520 Gabonese schoolchildren were tested for skin reaction to house-dust mite and other allergens, for Schistosoma haematobium eggs in urine, and for microfilariae in blood samples. Total and mite-specific IgE antibodies were measured. A subsample selected on the basis of their skin test to house-dust mite received detailed immunological investigations. Findings Children with urinary schistosomiasis had a lower prevalence of a positive skin reaction to house-dust mite than those free of this infection (odds ratio 0·32 [95% Cl 0·16-0·63]). The degree of sensitisation to house-dust mite could not explain this difference in skin-prick positivity. Schistosome-antigen-specific concentrations of interleukin-10 were significantly higher in infected children, and higher specific concentrations of this anti-inflammatory cytokine were negatively associated with the outcome of skin-test reactivity to mite (0·53 [0·30-0·96]). No association between polyclonal IgE antibodies and skin-test results was found. Interpretation The anti-inflammatory cytokine, interleukin-10, induced in chronic schistosomiasis, appears central to suppressing atopy in African children.

Schistosome infections are characterized by prominent T cell hyporesponsiveness during the chronic stage of infection. We found that schistosome-specific phosphatidylserine (PS) activated TLR2 and affected dendritic cells such that mature dendritic cells gained the ability to induce the development of IL-10-producing regulatory T cells. Using mass spectrometry, schistosomal lysophosphatidylserine (lyso-PS) was identified as the TLR2-activating molecule. This activity appears to be a unique property of schistosomal lyso-PS, containing specific acyl chains, because neither a synthetic lyso-PS (16:0) nor PS isolated from the mammalian host activates TLR2. Taken together, these findings provide evidence for a novel host-parasite interaction that may be central to long term survival of the parasite and limited host pathology with implications beyond parasitology. Schistosome infections are characterized by prominent T cell hyporesponsiveness during the chronic stage of infection. We found that schistosome-specific phosphatidylserine (PS) activated TLR2 and affected dendritic cells such that mature dendritic cells gained the ability to induce the development of IL-10-producing regulatory T cells. Using mass spectrometry, schistosomal lysophosphatidylserine (lyso-PS) was identified as the TLR2-activating molecule. This activity appears to be a unique property of schistosomal lyso-PS, containing specific acyl chains, because neither a synthetic lyso-PS (16:0) nor PS isolated from the mammalian host activates TLR2. Taken together, these findings provide evidence for a novel host-parasite interaction that may be central to long term survival of the parasite and limited host pathology with implications beyond parasitology. Schistosomes are trematodes that cause schistosomiasis, a chronic blood-vascular disease that is associated with a Th2 response (1Maizels R.M. Bundy D.A. Selkirk M.E. Smith D.F. Anderson R.M. Nature. 1993; 365: 797-805Google Scholar), but at chronic stages of infection also with enhanced IL-10 production and suppressed T cell proliferation to parasite antigens (2King C.L. Medhat A. Malhotra I. Nafeh M. Helmy A. Khaudary J. Ibrahim S. El Sherbiny M. Zaky S. Stupi R.J. Brustoski K. Shehata M. Shata M.T. J. Immunol. 1996; 156: 4715-4721Google Scholar). The anti-inflammatory responses induced by helminths seem to enable parasite survival within the host with limited inflammatory responses that might otherwise be destructive to the host tissues. This controlled immune response, central to chronic helminth infections, may arise from signals received from the pathogen, as the chronic presence of metabolically active helminths is mirrored by persistent challenge of the immune system with an array of molecules associated with parasite metabolism, reproduction, and attrition. Recognition of an invading microorganism by cells of the immune system involves pathogen-associated molecular patterns that bind specific germline-encoded receptors on the host cells. Toll-like receptors (TLRs) 1The abbreviations used are: TLR, Toll-like receptor; PS, phosphatidylserine; SEA, water-soluble egg antigen; MF, neutral maturation factors; IL, interleukin; FCS, fetal calf serum; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate; HKLM, heat-killed Listeria monocytogenes . with extracellular leucine-rich domains and intracellular IL-1 receptor homology domain are important members of such germline-encoded receptors and actively participate in the stimulation of innate immune responses. To date, ten TLR homologs have been found in humans, and ligands have been identified for several TLRs, most of which are of bacterial origin (3Poltorak A. He X. Smirnova I. Liu M.Y. Huffel C.V. Du X. Birdwell D. Alejos E. Silva M. Galanos C. Freudenberg M. Ricciardi-Castagnoli P. Layton B. Beutler B. Science. 1998; 282: 2085-2088Google Scholar, 4Hemmi H. Takeuchi O. Kawai T. Kaisho T. Sato S. Sanjo H. Matsumoto M. Hoshino K. Wagner H. Takeda K. Akira S. Nature. 2000; 408: 740-745Google Scholar, 5Means T.K. Lien E. Yoshimura A. Wang S. Golenbock D.T. Fenton M.J. J. Immunol. 1999; 163: 6748-6755Crossref Google Scholar). Instructions for development of specific immune responses are largely mediated by dendritic cells, which are present in peripheral tissues such as sentinel dendritic cells, and upon activation migrate to the draining lymph nodes to activate naive T cells, not only by presenting antigen but also by providing signals that determine polarization of T cell development toward a Th1 (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar, 7Cella M. Salio M. Sakakibara Y. Langen H. Julkunen I. Lanzavecchia A. J. Exp. Med. 1999; 189: 821-829Google Scholar), Th2 (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar), or T regulatory phenotype (8McGuirk P. McCann C. Mills K.H. J. Exp. Med. 2002; 195: 221-231Google Scholar). In this way, dendritic cells can play a central role in providing information on the nature of the invading pathogen by integrating signals received and conveying them to T cells by expressing a variety of factors that will determine differentiation of T cells into polarized subsets (9Kalinski P. Hilkens C.M. Wierenga E.A. Kapsenberg M.L. Immunol. Today. 1999; 20: 561-567Google Scholar). Dendritic cells express several TLRs, depending on their developmental stage and lineage (10Visintin A. Mazzoni A. Spitzer J.H. Wyllie D.H. Dower S.K. Segal D.M. J. Immunol. 2001; 166: 249-255Google Scholar, 11Kadowaki N. Ho S. Antonenko S. de Waal M.R. Kastelein R.A. Bazan F. Liu Y.J. J. Exp. Med. 2001; 194: 863-870Google Scholar). Recently, several studies have shown that bacterial products induce maturation of dendritic cells via TLRs (12Michelsen K.S. Aicher A. Mohaupt M. Hartung T. Dimmeler S. Kirschning C.J. Schumann R.R. J. Biol. Chem. 2001; 276: 25680-25686Google Scholar,13Hertz C.J. Kiertscher S.M. Godowski P.J. Bouis D.A. Norgard M.V. Roth M.D. Modlin R.L. J. Immunol. 2001; 166: 2444-2450Google Scholar). Furthermore, activation of TLR2 or TLR4 in immature dendritic cells can lead to expression of distinct cytokine profiles (14Re F. Strominger J.L. J. Biol. Chem. 2001; 276: 37692-37699Google Scholar). However, it is still unclear to what extent activation of TLRs on dendritic cells influences the T cell phenotype associated with infectious diseases. Several bacterial products considered as pathogen-associated molecular patterns have been shown to contain lipid moieties that are essential for activation of TLRs (15Muhlradt P.F. Kiess M. Meyer H. Sussmuth R. Jung G. J. Exp. Med. 1997; 185: 1951-1958Google Scholar, 16Noss E.H. Pai R.K. Sellati T.J. Radolf J.D. Belisle J. Golenbock D.T. Boom W.H. Harding C.V. J. Immunol. 2001; 167: 910-918Google Scholar, 17Aliprantis A.O. Yang R.B. Mark M.R. Suggett S. Devaux B. Radolf J.D. Klimpel G.R. Godowski P. Zychlinsky A. Science. 1999; 285: 736-739Google Scholar). Indeed, growing interest in lipids and their receptor biology has generated insights into interaction of this class of molecules with the immune system and into the role they may play in immunopathologies (18Hla T. Lee M.J. Ancellin N. Paik J.H. Kluk M.J. Science. 2001; 294: 1875-1878Google Scholar). A variety of lipid moieties can bind to specific receptors on the cells of the innate immune system and thereby play a role in immune regulation. For example, the binding of lysophosphatidylcholine to its receptor appears to have important immunomodulatory function because the deletion of the murine gene encoding the lysophosphatidylcholine-R (that is constitutively expressed in immune cells) resulted in adult-onset autoimmune disease similar to human systemic lupus erythematosus (19Le L.Q. Kabarowski J.H. Weng Z. Satterthwaite A.B. Harvill E.T. Jensen E.R. Miller J.F. Witte O.N. Immunity. 2001; 14: 561-571Google Scholar), α-galactosylceramide prevents onset or recurrence of autoimmune diabetes when presented in the context of the surface molecule CD1d (20Sharif S. Arreaza G.A. Zucker P. Mi Q.S. Sondhi J. Naidenko O.V. Kronenberg M. Koezuka Y. Delovitch T.L. Gombert J.M. Leite-De-Moraes M. Gouarin C. Zhu R. Hameg A. Nakayama T. Taniguchi M. Lepault F. Lehuen A. Bach J.F. Herbelin A. Nat. Med. 2001; 7: 1057-1062Google Scholar), and the platelet activating factor receptor induces the production of pro- or anti-inflammatory mediators when activated by PAF or oxidized phosphatidylcholine (21Walterscheid J.P. Ullrich S.E. Nghiem D.X. J. Exp. Med. 2002; 195: 171-179Google Scholar). Here, we have concentrated on the role of schistosome lipids in interaction with the innate immune system. We stimulated dendritic cells with lipid classes derived from Schistosoma mansonieggs and adult worms and found that the fraction containing phosphatidylserine (PS) polarized the maturation of dendritic cells, resulting in Th2 skewing and the development of T regulatory cells. The activation of TLR2 on dendritic cells by PS is essential for induction of development of IL-10-producing regulatory T cells. Using HPLC and tandem mass spectrometry, a unique schistosomal lysophosphatidylserine (lyso-PS) was identified as the TLR2-activating molecule. Thus, specific lyso-PS species from schistosomes act on dendritic cells via TLR2 to modify their T cell-stimulating property in such manner that regulatory T cells are induced. Lipids were isolated from S. mansoni adult worms and eggs and from the liver of a non-infected hamster and were fractionated using a TEAE-cellulose column as detailed before (22Van der Kleij D. Tielens A.G. Yazdanbakhsh M. Infect Immun. 1999; 67: 5946-5950Google Scholar). Briefly, S. mansoni adult worms were collected by perfusion of golden hamsters 45–48 days after infection. S. mansoni eggs were isolated from livers of infected hamsters after treatment of the liver homogenate with trypsin. Total lipids were isolated according to the method described by Bligh and Dyer (23Bligh E.G. Dyer W.J. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1959; 37: 911-917Google Scholar) and were separated into different classes using TEAE-cellulose column chromatography as described by Rouser et al. (24Rouser G. Kritchevsky G. Yamamoto A. Simon G. Galli C. Bauman A.J. Methods Enzymol. 1969; 14: 272-317Google Scholar). The fractions containing PS were used for stimulation of dendritic cells and HEK 293 cells. Synthetic lyso-PS (16:0) was purchased from Sigma. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from venous blood of healthy volunteers by density centrifugation on Ficoll. For peripheral blood mononuclear cell stimulation, cells were seeded in 96-well flat-bottom plates at 1 × 106 cells/well in RPMI medium as detailed before (25Grogan J.L. Kremsner P.G. Deelder A.M. Yazdanbakhsh M. European Journal of Immunology. 1996; 26: 1365-1370Google Scholar) in the presence of 5% FCS (Greiner) and were stimulated with 100 ng/ml lipopolysaccharide (Sigma) or 10 μg/ml schistosomal lipids that were dissolved by water bath sonication in RPMI containing 0.2% Me2SO. For generation of dendritic cells, monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells using a Percoll gradient as described previously (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar) and were cultured in RPMI medium supplemented with 10% FCS, human rGM-CSF (500 units/ml, specific activity 1.11 × 107 units/mg, a gift from Schering-Plough, Uden, The Netherlands) and human rIL-4 (250 units/ml) (R&D Systems). At day 3, the culture medium including the supplements was refreshed. At day 6, CD1a+CD14− immature dendritic cells were matured with maturation factors (MF) (either LPS (100 ng/ml) or a combination of IL-1β (10 ng/ml) (Strathmann Biotechnology, Hannover, Germany) and tumor necrosis factor α (50 ng/ml) (Strathman biotech) in the presence of IFN-γ (103 units/ml), which induces the development of dendritic cells that stimulate the polarization of naive T cells into Th1 (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar); PGE2 (10 μm), which induces the development of dendritic cells that stimulate the polarization of naive T cells into Th2 (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar); schistosome water-soluble egg antigen (SEA) (100 μg/ml), a parasite extract that induces the development of dendritic cells that stimulate the polarization of naive T cells into Th2 (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar); or phosphatidylserine isolated from schistosome eggs or adult worms (10 μg/ml). No differences in the level of maturation of dendritic cells exposed to the various compounds were found, as detected by CD83, CD80, CD86, and HLA-DR expression (data not shown), and therefore differential maturation could not play a role in the polarizing effects observed. In blocking experiments, 10 μg/ml of the anti-TLR2 antibody TL2.1 (26Lien E. Sellati T.J. Yoshimura A. Flo T.H. Rawadi G. Finberg R.W. Carroll J.D. Espevik T. Ingalls R.R. Radolf J.D. Golenbock D.T. J. Biol. Chem. 1999; 19;274: 33419-33425Google Scholar) or a mouse IgG2 control antibody (CLB, Amsterdam, The Netherlands) was added during dendritic cell maturation. After 48 h, mature CD1a+ CD83+dendritic cells were obtained. To measure cytokine production, 2 × 104 dendritic cells were co-cultured with 2 × 104 CD40L-expressing mouse fibroblasts (J558 cells; a kind gift from Dr. P. Lane, University of Birmingham, Birmingham, UK). Levels of IL12p70 were determined in 24-h supernatants by ELISA using monoclonal antibodies 20C2 (BD Biosciences) and biotinylated mouse-anti-hu IL-12 C8.6 (BD Biosciences) as coating and detection antibodies, respectively. Levels of IL-8 were determined using a commercial ELISA kit (CLB, Amsterdam, The Netherlands) following the manufacturer's recommendations. Highly purified CD4+CD45RA+CD45RO− naive Th cells (>98% as assessed by flow cytometry) were purified from peripheral blood mononuclear cells using a human CD4+/CD45RO− column kit (R & D Systems). 2 × 104 naive Th cells were co-cultured with 5 × 103 mature dendritic cells in the presence of superantigen Staphylococcus aureus enterotoxin B (Sigma) at a final concentration of 100 pg/ml in 96-well flat-bottom culture plates (Costar). At day 5, rhuIL-2 (10 units/ml, Cetus Corp., Emeryville, CA) was added and the cultures were expanded. On day 12, the quiescent Th cells were restimulated with immobilized CD3 mAb (CLB-T3/3, CLB, Amsterdam, The Netherlands) and soluble CD28 mAb (CLB-CD28/1, CLB), and IL-10 was measured in 24-h supernatants using a commercial kit (CLB) following the manufacturer's recommendations. To measure the frequency of IL-4- and IFN-γ-producing cells, Th cells were restimulated with PMA (Sigma) and ionomycin (Sigma) in the presence of brefeldinA (Sigma) for 6 h. To detect intracellular production of IL-4 and IFN-γ, cells were stained using anti-hu-IL-4-PE (BD Biosciences) and anti-hu-IFN-γ-FITC (BD Biosciences). To assess regulatory capacity, the effect of T cells (grown in the presence of dendritic cells that were matured with MF and during maturation exposed to IFN-γ, PGE2, SEA, PS from eggs or PS from worms) on proliferation of autologous Th cells was measured. T cells grown in the presence of unpolarized dendritic cells (matured with MF) were used as target cells for regulation. Effector T cells (5 × 104 cells/well) were co-cultured with target cells (5 × 104 cells/well) in the presence of unpolarized mature dendritic cells (MF dendritic cells) (5 × 103 cells/well). Cultures were done in triplicates. [3H]Thymidine was added after 3 days of culture, and incorporation was measured after a 16-h pulse. The background proliferation of effector T cells (i.e. T-effector + dendritic cells) was subtracted from the proliferation when target cells were added (i.e. T-effector + dendritic cells + T-target). Wild-type and TLR2 knockout mice (27Takeuchi O. Hoshino K. Akira S. J. Immunol. 2000; 165: 5392-5396Google Scholar, 28Takeuchi O. Hoshino K. Kawai T. Sanjo H. Takada H. Ogawa T. Takeda K. Akira S. Immunity. 1999; 11: 443-451Google Scholar) were inoculated intraperitoneally with 2.5 ml of 3% thioglycolate solution. Peritoneal exudate cells were harvested with cold RPMI 1640 medium containing 10% FCS and 10 μg/ml ciprofloxacin (gift from Miles Pharmaceuticals, West Haven, CT) 72 h post-inoculation. The cells were washed and seeded at a density of 0.5 × 106 cells/well in 96-well flat-bottom plates. After 24 h, non-adherent cells were removed by washing, and the adherent cells were stimulated with repurified LPS (100 pg/ml) fromEscherichia coli K 235 (gift from S. Vogel, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, MD), heat-killedListeria monocytogenes (HKLM) (106 cells/ml) (29Flo T.H. Halaas O. Lien E. Ryan L. Teti G. Golenbock D.T. Sundan A. Espevik T. J. Immunol. 2000; 164: 2064-2069Google Scholar), and schistosomal egg and adult worm PS (10 μg/ml). Tumor necrosis factor α production was measured after 20 h using a commercial DuoSet ELISA kit (R & D Systems). HEK 293 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (BioWhittaker) supplemented with 10% FCS (Hyclone) and 10 μg/ml ciprofloxacin. The cells were transiently transfected at a density of 0.2 × 106cells/well in 12-well plates using PolyFect transfection reagent (Qiagen) with 0.5 μg/transfection TLR-expression plasmid and 0.5 μg/transfection pELAM-luc, a reporter construct that transcribes firefly luciferase from an NF-κB-dependent promoter, as described previously (30Chow J.C. Young D.W. Golenbock D.T. Christ W.J. Gusovsky F. J. Biol. Chem. 1999; 274: 10689-10692Google Scholar). FLAG-tagged human TLR1 and TLR2 were provided by Tularic (San Francisco, CA), FLAG-tagged TLR3 was PCR-cloned from a cDNA (DNAX, Palo Alto, CA) into pFLAG-CMV1. Non-tagged human TLR4 (hTOLL) in pcDNA3 was a gift from C. Janeway and R. Medzhitov (Yale University, New Haven, CT) and was co-transfected with human MD-2 (0.25 μg DNA/transfection of TLR4 and MD-2), a gift from K. Miyake (University of Tokyo, Japan), FLAG-tagged TLR7 was cloned from genomic DNA into pFLAG-CMV1 and FLAG-tagged TLR9 was a gift from S. Akira (Osaka University, Japan). 24 h after transfection, cells were washed with phosphate-buffered saline and stimulated with IL-1β (100 ng/ml) (Genzyme Pharmaceuticals, Cambridge, MA), HKLM (105bacteria/ml), poly(IC) (100 μg/ml) (Amersham Biosciences), repurified LPS (100 ng/ml), phosphothioate-stabilized CpG oligodeoxynucleotides (10 μm, 2006–TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, gift from K. Heeg, Institute for Microbiology, Marburg, Germany) or schistosomal adult worm or egg PS fraction (10 μg/ml). Six hours after stimulation, cells were lysed in reporter lysis buffer (Promega, Madison, WI), and luciferase activity of the cellular lysate was measured using an assay kit from Promega (Madison, WI) per the manufacturer's protocol. HEK 293-CD14 and HEK 293-CD14/TLR2 cell lines were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FCS, 10 μg/ml ciprofloxacin, and 5 μg/ml puromycin. For stimulation experiments, cells were seeded at 0.2 × 106 cells/well in 96-well flat-bottom plates and were stimulated the next day with PS fractions from schistosomes or hamster liver (5 μg/ml). IL-8 production was measured in supernatants after 20 h using a commercial kit (CLB) following the manufacturer's recommendations. The schistosomal PS preparations were separated by HPLC using a 5-μm Lichrosphere diol normal-phase column (Merck). Elution was performed at a flow rate of 1 ml/min by a gradient from 95% eluent A (hexane/isopropanol/acetone (82:17:1)) and 5% eluent B (isopropanol/water/acetone (85:14:1)) to 60% A and 40% B in 30 min, followed by additional elution with the latter solvent for 10 min. Fractions were collected manually, evaporated to dryness, and used to stimulate HEK-CD14/TLR2 cells. Both the total PS preparations and the TLR2-activating HPLC fraction were analyzed using mass spectrometry. Mass spectrometry was performed on an API-365 triple quad mass spectrometer (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan de IJssel, The Netherlands) equipped with an electrospray ionization source. Negative ionization spectra were recorded at a scan rate of 200 atomic mass units (amu) per second, using an ion spray voltage of −4500 V, a declustering potential (cone voltage) of 30 V, and a focusing potential of 210 V. Alternatively, PS and lyso-PS were analyzed by recording neutral loss spectra of 87 amu in the negative ionization mode at ion spray-, decluster-, and focusing potentials mentioned above and with a collision energy of 34 V (r). Nitrogen was used as collision- and curtain gas and air as the nebulizing gas. For digestion with phospholipase C, 100 μg of the schistosomal adult worm PS fraction was incubated in 2 ml of diethyl ether and 1 ml of Tris-HCl buffer (pH 7.2) supplemented with 5 mmCaCl2 and 1.3 units/ml phospholipase C (Sigma) during 3 h while shaking. As a control, schistosomal PS was incubated in the same buffer in the absence of phospholipase C. After hydrolysis, the ether was evaporated and lipids were extracted according to Bligh and Dyer (23Bligh E.G. Dyer W.J. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1959; 37: 911-917Google Scholar). Data were analyzed for statistical significance using a paired t test. To study whether lipids from helminths are involved in interaction with the immune system, lipid classes derived from S. mansoni eggs and adult worms were fractionated on an anion exchange column and were screened for activity by their capacity to stimulate cytokine production (IL-6, IL-8, IL-10, or tumor necrosis factor α) by peripheral blood mononuclear cells isolated from non-exposed individuals. We found that the lipid fraction containing PS was an inducer of cytokine production (data not shown), and we proceeded to investigate its effects on dendritic cells and subsequent T cell polarization. So-called dendritic cells type-1 (DC1) have previously been shown to induce development of Th1 cells, whereas DC2 cells have been found to promote Th2 development (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar). Human monocyte-derived dendritic cells were exposed to schistosomal PS, schistosomal SEA, a parasite antigen preparation that has previously been shown to induce DC2 development (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar), and as controls, IFN-γ (which induces the development of DC1) or PGE2 (which stimulates the development of DC2) in combination with neutral maturation factors (MF). After several washing steps, the fully matured dendritic cells were tested for cytokine production and used to prime naive T cells. We found that as reported before (6de Jong E.C. Vieira P.L. Kalinski P. Schuitemaker J.H. Tanaka Y. Wierenga E.A. Yazdanbakhsh M. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 2002; 168: 1704-1709Google Scholar), upon stimulation with CD40-ligand (a molecule expressed on T cells that activates dendritic cells), the IFN-γ exposed dendritic cells produced high levels of IL-12p70 (IFN-γ-dendritic cells, 6.2 ± 0.4 ng/ml) compared with mature control dendritic cells (2.1 ± 0.3 ng/ml) and enhanced the development of Th1 cells (Fig1A), whereas PGE2- and SEA-exposed dendritic cells had suppressed IL-12p70 production (PGE2-dendritic cells, 0.3 ± 0.2 ng/ml and SEA-dendritic cells, 0.3 ± 0.1 ng/ml) and increased frequency of IL-4 producing T cells (Th2 cells) with decreasing numbers of IFN-γ producing T cells (Fig 1A). The schistosome fraction containing PS extracted from adult worms or eggs polarized the maturation of dendritic cells, resulting in low IL-12p70 release (PS eggs-dendritic cells, 0.4 ± 0.2 ng/ml, PS worms-dendritic cells, 0.4 ± 0.1 ng/ml) and not only in Th2 skewing (Fig 1A) but in contrast to SEA and PGE2, also in the development of IL-10 producing T cells (Fig1B). T cells that develop in co-culture with dendritic cells, which were matured in the presence of schistosomal PS, are capable of suppressing proliferation of autologous Th cells significantly at a Treg:Ttarget cell ratio of 1:1 (Fig 1C). Inhibition of proliferation was reduced to 50% at a Treg:Ttarget cell ratio of 1:2, and no inhibition was detectable at a 1:4 ratio. The observed suppression of proliferation was abrogated when a blocking IL-10 antibody was present in the co-culture of regulatory T cells (Treg) and target T cells (Fig. 1D), suggesting that the Treg cells exert their inhibitory function via IL-10. The low IL-12p70 production was not caused by PS toxicity, because production of another cytokine (IL-8) by dendritic cells was unaffected or even enhanced and also no apoptotic cells were detected as determined using the method described by Nicoletti et al.(31Nicoletti I. Migliorati G. Pagliacci M.C. Grignani F. Riccardi C. J. Immunol. Methods. 1991; 139: 271-279Google Scholar) (data not shown). Taken together, the maturation of dendritic cells in the presence of schistosome egg- or adult worm-PS leads to the development of dendritic cells capable of inducing Tregcells. This is specific for schistosomal PS, as dendritic cells matured in the presence of SEA or PGE2 (which polarize toward Th2) lacked the capacity to stimulate the development of the IL-10-producing Treg cells. The mechanism whereby dendritic cells matured in the presence of schistosomal PS induce IL-10-producing T cells is currently being investigated. Preliminary experiments show that whereas dendritic cell-derived soluble factors present in supernatants mediate Th2 development, cell-cell contact is required for Tregcell induction. We transiently transfected HEK 293 cells with human TLR1, TLR2, TLR3, TLR4+MD2, TLR7, and TLR9 to elucidate the mechanism by which schistosomal PS interacts with cells of the innate immune system. On stimulation with schistosomal PS, only cells transfected with TLR2 were activated (Fig. 2A). These results were confirmed by using peritoneal macrophages of TLR2 −/− mice, which were unresponsive to schistosomal PS, whereas macrophages of the control mice showed a clear response (Fig. 2B). When an anti-TLR2 antibody was added during dendritic cell maturation in the presence of schistosomal PS, the development of IL-10-producing T cells was diminished (Fig 3A) whereas Th2 polarization was not affected (Fig. 3B), indicating that TLR2 plays a role in specifically promoting the development of regulatory T cells, but not Th2 cells.Figure 3TLR2 activation on dendritic cells is essential for the development of IL-10 producing T cells.Dendritic cells were matured with MF alone (−) or with MF and PS worms (10 μg/ml) in the presence of a TLR2 blocking antibody or a control antibody. After maturation, dendritic cells were co-cultured with naive T cells, which after 12 days were restimulated with immobilized CD3 and soluble CD28 (A) to measure IL-10 in 24-h supernatants (results of 3 independent experiments are shown as mean ± S.D., **, p < 0.01) or PMA and ionomycin in the presence of brefeldin A (B) and examined for intracellular IL-4 and IFN-γ (one representative of 3 independent experiments is shown).View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) To confirm that the active molecule present in the schistosomal PS fractions is indeed a phospholipid and not a minor compound not detectable by mass spectrometry, the schistosomal PS fraction was treated with phospholipase C, which removes the phosphoserine head group from the acylglycerol moiety, and subsequently HEK CD14/TLR2 stably transfected cells were stimulated with the resulting lipid fraction. On phospholipase C digestion, the TLR2-stimulating activity was significantly reduced (Fig. 4A), indicating that the phosphoserine head group is required for TLR2 activation. Phosphoserine alone did not have any TLR2-stimulating activity on HEK CD14/TLR2 cells (Fig. 4B), demonstrating that both the acyl group and the phosphoserine moieties of PS form a combined epitope for activity. In addition, HEK 293 cells stably transfected with TLR2 responded to schistosomal PS in a dose-dependent manner, but did not respond to any concentration of PS isolated from the liver of a non-infected mammalian host (a golden hamster) (Fig. 4B). In agreement with the observation that mammalian PS did not activate TLR2, it also did not affect dendritic cell maturation (data not shown). To identify the structure of the TLR2-activating molecule within the schistosomal PS preparations, we analyzed the contents of the PS preparations extracted from schistosome adult worms and eggs and hamster liver using HPLC and tandem mass spectrometry (Fig. 4,C, D and E, respectively). The PS-containing fractions comprised a variety of molecules, but they all showed the typical loss of a serine head group (with a mass of 87 Da) and showed a great variety in the number of C atoms and presence of double bonds in the acyl chains. Strikingly, both in the schistosomal worm and egg PS fractions, PS molecules containing only one acyl chain (so-called lyso-PS molecules) were found, whereas such molecules could not be detected in the hamster liver PS ex

Upon microbial infection, specific Th1 or Th2 responses develop depending on the type of microbe. Here, we demonstrate that different microbial compounds polarize the maturation of human myeloid dendritic cells (DCs) into stably committed Th1 cell-promoting (DC1) or Th2 cell-promoting (DC2) effector DCs that polarize Th cells via different mechanisms. Protein extract derived from the helminth Schistosoma mansoni induced the development of DC2s that promote the development of Th2 cells via the enhanced expression of OX40 ligand. Likewise, toxin from the extracellular bacterium Vibrio cholerae induced development of DC2s as well, however, via an OX40 ligand-independent, still unknown mechanism. In contrast, toxin from the intracellular bacterium Bordetella pertussis induced the development of DC1s with enhanced IL-12 production, which promotes a Th1 cell development. Poly(I:C) (dsRNA, mimic for virus) induced the development of extremely potent Th1-inducing DC1, surprisingly, without an enhanced IL-12 production. The obtained DC1s and DC2s are genuine effector cells that stably express Th cell-polarizing factors and are unresponsive to further modulation. The data suggest that the molecular basis of Th1/Th2 polarization via DCs is unexpectedly diverse and is adapted to the nature of the microbial compounds.

Soluble egg antigens of the parasitic helminth Schistosoma mansoni (S. mansoni egg antigen [SEA]) induce strong Th2 responses both in vitro and in vivo. However, the specific molecules that prime the development of Th2 responses have not been identified. We report that omega-1, a glycoprotein which is secreted from S. mansoni eggs and present in SEA, is capable of conditioning human monocyte-derived dendritic cells in vitro to drive T helper 2 (Th2) polarization with similar characteristics as whole SEA. Furthermore, using IL-4 dual reporter mice, we show that both natural and recombinant omega-1 alone are sufficient to generate Th2 responses in vivo, even in the absence of IL-4R signaling. Finally, omega-1-depleted SEA displays an impaired capacity for Th2 priming in vitro, but not in vivo, suggesting the existence of additional factors within SEA that can compensate for the omega-1-mediated effects. Collectively, we identify omega-1, a single component of SEA, as a potent inducer of Th2 responses.

We used a deeply sequenced dataset of 910 individuals, all of African descent, to construct a set of DNA sequences that is present in these individuals but missing from the reference human genome. We aligned 1.19 trillion reads from the 910 individuals to the reference genome (GRCh38), collected all reads that failed to align, and assembled these reads into contiguous sequences (contigs). We then compared all contigs to one another to identify a set of unique sequences representing regions of the African pan-genome missing from the reference genome. Our analysis revealed 296,485,284 bp in 125,715 distinct contigs present in the populations of African descent, demonstrating that the African pan-genome contains ~10% more DNA than the current human reference genome. Although the functional significance of nearly all of this sequence is unknown, 387 of the novel contigs fall within 315 distinct protein-coding genes, and the rest appear to be intergenic. Assembly of a pan-genome from 910 humans of African descent identifies 296.5 Mb of novel DNA mapping to 125,715 distinct contigs. This African pan-genome contains ~10% more DNA than the current human reference genome.

Abstract Type 2 immunity plays an essential role in the maintenance of metabolic homeostasis and its disruption during obesity promotes meta-inflammation and insulin resistance. Infection with the helminth parasite Schistosoma mansoni and treatment with its soluble egg antigens (SEA) can induce a type 2 immune response in metabolic organs and improve insulin sensitivity and glucose tolerance in obese mice, yet a causal relationship remains unproven. Here, we investigated the effects and underlying mechanisms of the T2 ribonuclease omega-1 (ω1), one of the major S. mansoni immunomodulatory glycoproteins, on metabolic homeostasis. Male C57Bl6/J mice were fed a high-fat diet for 12 weeks followed by bi-weekly injection of SEA, ω1 or vehicle for 4 additional weeks. Whole-body metabolic homeostasis and energy expenditure were assessed by glucose/insulin tolerance tests and indirect calorimetry, respectively. Tissue-specific immune cell phenotypes were determined by flow cytometry. We show that treatment of obese mice with plant-produced recombinant ω1, harboring similar glycan motifs as present on the native molecule, decreased body fat mass and improved systemic insulin sensitivity and glucose tolerance in a time-and dose-dependent manner. This effect was associated with an increase in white adipose tissue (WAT) type 2 T helper cells, eosinophils and alternatively-activated macrophages, without affecting type 2 innate lymphoid cells. In contrast to SEA, the metabolic effects of ω1 were still observed in obese STAT6-deficient mice with impaired type 2 immunity, indicating that its metabolic effects are independent of the type 2 immune response. Instead, we found that ω1 inhibited food intake, without affecting locomotor activity, WAT thermogenic capacity or whole-body energy expenditure, an effect also occurring in leptin receptor-deficient obese and hyperphagic db/db mice. Altogether, we demonstrate that while the helminth glycoprotein ω1 can induce type 2 immunity, it improves whole-body metabolic homeostasis in obese mice by inhibiting food intake via a STAT6-independent mechanism. Author summary The obesity-induced chronic low-grade inflammation, notably in adipose tissue, contributes to insulin resistance and increased risk of type 2 diabetes. We have previously shown that infection with parasitic helminth worms was associated with protection against obesity-related metabolic dysfunctions both in mice and humans. We have also reported that treatment of obese mice with an extract of Schistosoma mansoni eggs (SEA) improves insulin sensitivity and glucose tolerance, a beneficial effect that was associated with a helminth-specific type 2 immune response in metabolic organs. Here, we studied the effects of omega-1 (ω1), a single immunomodulatory molecule from SEA, on metabolic health in obese mice, and investigated the role of the host immune response elicited. We found that ω1 induced a helminth-characteristic type 2 immune response in adipose tissue and improved both insulin sensitivity and glucose tolerance in obese mice. Yet, in contrast to SEA, ω1’s immunomodulatory properties were dispensable for its metabolic effects. Instead, we show that ω1 inhibited food intake, a feature accounting for most of the improvements in metabolic health. Together, our findings indicate that helminth molecules may improve metabolic health through multiple distinct mechanisms, and further characterization of such molecules could lead to new therapeutic strategies to combat obesity.

Abstract SARS-CoV2 infection results in a range of disease severities, but the underlying differential pathogenesis is still not completely understood. At presentation it remains difficult to estimate and predict severity, in particular, identify individuals at greatest risk of progression towards the most severe disease-states. Here we used advanced models with circulating serum analytes as variables in combination with daily assessment of disease severity using the SCODA-score, not only at single time points but also during the course of disease, to correlate analyte levels and disease severity. We identified a remarkably strong pro-inflammatory cytokine/chemokine profile with high levels for sCD163, CCL20, HGF, CHintinase3like1 and Pentraxin3 in serum which correlated with COVID-19 disease severity and overall outcome. Although precise analyte levels differed, resulting biomarker profiles were highly similar at early and late disease stages, and even during convalescence similar biomarkers were elevated and further included CXCL3, CXCL6 and Osteopontin. Taken together, strong pro-inflammatory marker profiles were identified in patients with COVID-19 disease which correlated with overall outcome and disease severity.

Chronic infection with Schistosoma mansoni parasites is associated with reduced allergic sensitization in humans, while schistosome eggs protects against allergic airway inflammation (AAI) in mice. One of the main secretory/excretory molecules from schistosome eggs is the glycosylated T2-RNAse Omega-1 (ω1). We hypothesized that ω1 induces protection against AAI during infection. Peritoneal administration of ω1 prior to sensitization with Ovalbumin (OVA) reduced airway eosinophilia and pathology, and OVA-specific Th2 responses upon challenge, independent from changes in regulatory T cells. ω1 was taken up by monocyte-derived dendritic cells, mannose receptor (CD206)-positive conventional type 2 dendritic cells (CD206 + cDC2), and by recruited peritoneal macrophages. Additionally, ω1 impaired CCR7, F-actin, and costimulatory molecule expression on myeloid cells and cDC2 migration in and ex vivo , as evidenced by reduced OVA + CD206 + cDC2 in the draining mediastinal lymph nodes (medLn) and retainment in the peritoneal cavity, while antigen processing and presentation in cDC2 were not affected by ω1 treatment. Importantly, RNAse mutant ω1 was unable to reduce AAI or affect DC migration, indicating that ω1 effects are dependent on its RNAse activity. Altogether, ω1 hampers migration of OVA + cDC2 to the draining medLn in mice, elucidating how ω1 prevents allergic airway inflammation in the OVA/alum mouse model.

Abstract Pro-inflammatory activation of macrophages in metabolic tissues is critically important in induction of obesity-induced metaflammation. Here, we demonstrate that the soluble mannose receptor (sMR) plays a direct, functional role in both macrophage activation and metaflammation. We show that sMR binds CD45 on macrophages and inhibits its phosphatase activity, leading to a Src/Akt/NF-κB-mediated cellular reprogramming towards an inflammatory phenotype both in vitro and in vivo. Remarkably, increased serum sMR levels were observed in obese mice and humans and directly correlated with body weight. Additionally, MR deficiency lowers pro-inflammatory macrophages in metabolic tissues and protects against hepatic steatosis and whole-body metabolic dysfunctions in high-fat diet-induced obese mice. Conversely, administration of sMR in lean mice increases serum pro-inflammatory cytokines, activates tissue macrophages and promotes insulin resistance. Altogether, our results reveal sMR as novel regulator of pro-inflammatory macrophage activation which could constitute a new therapeutic target for metaflammation and other hyperinflammatory diseases.