Abstract Reproducibility issues regarding in vitro cell culture experiments are related to genetic fluctuations and batch-wise variations of biological materials such as fetal calf serum (FCS). Genome sequencing may control the former, while the latter may remain unrecognized. Using a U937 macrophage model for cell differentiation and inflammation, we investigated whether the formation of effector molecules was dependent on the FCS batch used for cultivation. High resolution mass spectrometry was used to identify FCS constituents and to explore their effects on cultured cells evaluating secreted cytokines, eicosanoids and other inflammatory mediators. Remarkably, the FCS eicosanoid composition showed more batch-dependent variations than the protein composition. Efficient uptake of fatty acids from medium by U937 macrophages and inflammation-induced release thereof was evidenced using C13-labelled arachidonic acid, highlighting rapid lipid metabolism. For functional testing, FCS batch-dependent nanomolar concentration differences of two selected eicosanoids, 5-HETE and 15-HETE, were balanced out by spiking in. Culturing U937 cells at these defined conditions indeed resulted in significant proteome alterations indicating HETE-induced PPARγ activation, independently corroborated by HETE-induced formation of peroxisomes observed by high-resolution microscopy. In conclusion, the present data demonstrate that FCS-contained eicosanoids, subject to substantial batch-wise variation, may modulate cellular effector functions in cell culture experiments.

It is still a question of debate whether neutrophils, often found in the tumor microenvironment, mediate tumor-promoting or rather tumor-inhibiting activities. The present study focusses on the involvement of neutrophils in high grade serous ovarian cancer (HGSOC). Multi-omics data comprising proteomics, eicosadomics, metabolomics, Luminex-based cytokinomics, and FACS data were generated from ascites samples. Integrated data analysis demonstrates a significant increase of neutrophil extracellular trap- (NET) associated molecules in non-miliary ascites samples. A co-association network analysis performed with the ascites data further revealed a striking co-correlation between NETosis-associated metabolites with several eicosanoids. Investigating primary neutrophils from healthy domors, NET formation was induced using ionomycin or phorbol ester. Data congruence with ascites analyses indicated the predominance of NOX-independent NETosis. NETosis is associated with S100A8/A9 release. An increase of the S100A8/CRP abundance ratio was found to correlate with improved survival of HGSOC patients. The analysis of additional five independent proteome studies with regard to S100A8/CRP ratios confirmed this observation. In conclusion, here we present evidence that increased NET formation relates to improved outcomes in cancer patients.

Covalent drugs emerged as a promising addition to the arsenal of medicinal chemistry tools. Here, a gold-templated mechanism is exploited to enable the selective covalent targeting of the CysSec-dyad of thioredoxin reductase 1 (TXNRD1) in cancer cells. This two-step mechanism involves reversible coordination of a cyclometalated gold(III) compound, featuring a bidentate CˆN ligand, to thiolates/selenolates, followed by reductive elimination and irreversible covalent cross-coupling reaction of the ligand to these nucleophiles. Following this reactivity, potent inhibition of TXNRD1 activity was shown in vitro, including cancer cell extracts. Selective arylation of the CysSec-dyad in the presence of reducing equivalents was seen in cell-free studies. Chemoproteomic studies showed that the proposed mechanism is selective toward specific protein targets, including TXNRD1. Proteome profiling revealed down-regulation of the detected selenoproteins, except TXNRD1, and induction of the NRF2-KEAP1 pathway. Metal-templated covalent targeting may prove useful to rationally expand the ligandable space of covalent drug discovery.