Article2 March 1998free access Axin, a negative regulator of the Wnt signaling pathway, forms a complex with GSK-3β and β-catenin and promotes GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin Satoshi Ikeda Satoshi Ikeda Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Shosei Kishida Shosei Kishida Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Hideki Yamamoto Hideki Yamamoto Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Hiroshi Murai Hiroshi Murai Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Shinya Koyama Shinya Koyama Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Akira Kikuchi Corresponding Author Akira Kikuchi Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Satoshi Ikeda Satoshi Ikeda Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Shosei Kishida Shosei Kishida Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Hideki Yamamoto Hideki Yamamoto Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Hiroshi Murai Hiroshi Murai Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Shinya Koyama Shinya Koyama Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Akira Kikuchi Corresponding Author Akira Kikuchi Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan Search for more papers by this author Author Information Satoshi Ikeda1, Shosei Kishida1, Hideki Yamamoto1, Hiroshi Murai1, Shinya Koyama1 and Akira Kikuchi 1 1Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8551 Japan *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (1998)17:1371-1384https://doi.org/10.1093/emboj/17.5.1371 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) mediates epidermal growth factor, insulin and Wnt signals to various downstream events such as glycogen metabolism, gene expression, proliferation and differentiation. We have isolated here a GSK-3β-interacting protein from a rat brain cDNA library using a yeast two-hybrid method. This protein consists of 832 amino acids and possesses Regulators of G protein Signaling (RGS) and dishevelled (Dsh) homologous domains in its N- and C-terminal regions, respectively. The predicted amino acid sequence of this GSK-3β-interacting protein shows 94% identity with mouse Axin, which recently has been identified as a negative regulator of the Wnt signaling pathway; therefore, we termed this protein rAxin (rat Axin). rAxin interacted directly with, and was phosphorylated by, GSK-3β. rAxin also interacted directly with the armadillo repeats of β-catenin. The binding site of rAxin for GSK-3β was distinct from the β-catenin-binding site, and these three proteins formed a ternary complex. Furthermore, rAxin promoted GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin. These results suggest that rAxin negatively regulates the Wnt signaling pathway by interacting with GSK-3β and β-catenin and mediating the signal from GSK-3β to β-catenin. Introduction Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) was originally characterized as a serine/threonine kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase, and subsequently was demonstrated to be identical to protein kinase FA that activates ATP-Mg-dependent type-1 protein phosphatase (Plyte et al., 1992). GSK-3 is now implicated in the regulation of several physiological responses in mammalian cells by phosphorylating many substrates including neuronal cell adhesion molecule, neurofilament, synapsin I, tau, transcription factors and adenomatous polyposis coli (APC) gene product (Mandelkow et al., 1992; Plyte et al., 1992; Yang et al., 1992; Rubinfeld et al., 1996). The cDNAs of GSK-3α and GSK-3β in mammals have been isolated and they encode the protein kinases with Mrs of 51 and 47 kDa, respectively (Woodgett, 1990). Mammalian GSK-3β is structurally and functionally homologous to the Drosophila zeste-white3/shaggy gene product (Ruel et al., 1993). The shaggy gene product has been found to be required at several developmental stages during fruit fly embryogenesis for correct embryogenic segmentation (Simpson et al., 1988; Perrimon and Smouse, 1989). In Saccharomyces cerevisiae, the MCK1 and MDS1 genes encode serine/threonine kinases which are homologous to mammalian GSK-3 and to the Drosophila shaggy gene product. The MCK1 and MDS1 gene products play a role in the chromosomal segregation processes (Puziss et al., 1994). In Schizosaccharomyces pombe, the skp1+ gene product is a homolog of GSK-3 and regulates cytokinesis (Plyte et al., 1996). Xenopus GSK-3 has been shown to regulate ventral differentiation during early Xenopus development (He et al., 1995). Furthermore, the Dictyostelium homolog of GSK-3 (GSKA) has been found to be important for cellular differentiation (Harwood et al., 1995). Thus, GSK-3 is highly conserved throughout evolution and plays a fundamental role in cellular responses. Genetic evidence reveals that Drosophila wingless signals through an intracellular cascade that includes dishevelled (Dsh), shaggy and armadillo, a β-catenin homolog (Miller and Moon, 1996; Nusse, 1997). In the absence of a wingless signal, shaggy antagonizes downstream elements of the wingless pathway via changes in the level of armadillo and, in response to wingless signaling, there is a decrease in the phosphorylation of armadillo and an increase in its stability. In Xenopus, interference with GSK-3 induces an ectopic dorsal axis which is identical to that resulting from overexpression of Wnt and β-catenin (He et al., 1995). In mammals, it has been shown also that GSK-3 is inactivated by Wnt, although the mechanism is not clear (Cook et al., 1996), and that β-catenin accumulates in the cytoplasm following the Wnt signals and translocates to the nucleus (Polakis, 1997). This translocation involves the association of β-catenin with the transcriptional enhancers of lymphocyte enhancer binding factor/T cell factor (LEF/TCF) family (Behrens et al., 1996; Molenaar et al., 1996). A dominant-negative form of Xenopus TCF-3 inhibits axis formation (Molenaar et al., 1996). Furthermore, it has been shown that GSK-3β phosphorylates APC and that the phosphorylation enhances the binding of APC to β-catenin (Rubinfeld et al., 1996). It is well known that APC is required for the degradation of β-catenin, although the role of APC is not well understood (Polakis, 1997). Thus, the Wnt signaling pathway through GSK-3β regulates the determination of cell fate. In specifying cell fate, GSK-3β may interact with several cellular targets. Apart from the demonstration of GSK-3β binding to APC–β-catenin complex (Rubinfeld et al., 1996), GSK-3β may have other binding partners as well. β-Catenin has a consensus sequence phosphorylation site for GSK-3β, and GSK-3β acts to cause the degradation of β-catenin (Miller and Moon, 1996). Elimination of the possible phosphorylation site increases the stability of β-catenin (Munemitsu et al., 1996; Yost et al., 1996). It has been shown recently that the ubiquitination–proteasome pathway is involved in the degradation of β-catenin and that mutations in the GSK-3β consensus phosphorylation site of β-catenin prevent ubiquitination (Aberle et al., 1997). Thus, it appears that GSK-3β phosphorylates β-catenin and that the phosphorylation of β-catenin is essential for its degradation. Indeed, it has been reported that in Xenopus, GSK-3β phosphorylates β-catenin in vitro (Yost et al., 1996). However, it has been shown that mammalian GSK-3β does not significantly phosphorylate β-catenin in vitro (Rubinfeld et al., 1996). These results suggest that the factor(s) involved in the phosphorylation of β-catenin may be lost. To obtain further insights into the action of GSK-3β on the degradation of β-catenin, we have tried to find a GSK-3β-interacting protein using a yeast two-hybrid method. From a rat brain cDNA library, we have isolated a protein which interacts with GSK-3β, and we found that this protein shared 94% identity with mouse Axin (Zeng et al., 1997), indicating that it is rat Axin (rAxin). Axin has been found to regulate negatively a critical step in the formation of the embryonic axis and exert its effects at a very early stage by specifically inhibiting the Wnt signaling pathway (Zeng et al., 1997). We show here that rAxin is phosphorylated by GSK-3β and that it directly interacts with both GSK-3β and β-catenin. Furthermore, we demonstrate that rAxin promotes GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin. These results suggest that Axin negatively regulates the Wnt signaling pathway by interacting with GSK-3β and β-catenin and mediating the signal from GSK-3β to β-catenin. Results Isolation of GSK-3β-interacting protein To identify proteins that physically interact with GSK-3β, we conducted a rat brain cDNA library screening by the yeast two-hybrid method. From 3.7×106 initial transformants, four clones were found to confer both the His+ and LacZ+ phenotypes on L40 containing pBTM116HA/GSK-3β. Among these, a 3.2 kb cDNA insert was found to encode a sequence containing a long open reading frame (ORF) and the consensus sequence for a stop codon. Further, the protein encoded by this cDNA shared high homology with Regulators of G protein Signaling (RGS) and Dsh. Therefore, we tried to characterize this clone and did not analyze the other clones further here. A full-length cDNA of this GSK-3β-interacting protein was isolated from a rat brain cDNA library. This clone spanned a distance of 3.5 kb and contained an uninterrupted ORF of 2496 bp, encoding a predicted protein of 832 amino acids with a calculated Mr of 92 855 Da (Figure 1A). The first ATG was preceded by stop codons in all three reading frames, and the 5′-non-coding region had a high percentage of GC base pairs (81%). The neighboring sequence of the second ATG was more consistent than that of the first with the translation initiation start proposed by Kozak (1987), but we could not determine which is the first Met. When we isolated this cDNA, besides dbEST sequences (DDBJ/EMBL/GenBank Accession nos: AA198606, AA028403, AA238939, W97777, AA259709 and AA170717), no protein closely related to this GSK-3β-interacting protein was identified. However, during preparation of this manuscript, this protein was found to share 94% amino acid identity with mouse Axin (Zeng et al., 1997), so we designated this GSK-3β-interacting protein rAxin (rat Axin). Although it appears that the ORF of mouse Axin extends upstream of rAxin, it has been suggested that the first or second Met of mouse Axin, which is in the same position as that of rAxin, could serve as an initiation codon (Zeng et al., 1997). There are alternative splicing products, termed form 1 and 2, in mouse Axin. A 36 amino acid segment is inserted in form 2. The rAxin that we isolated is form 1, since 36 amino acids which correspond to mouse Axin (860–895) are lacking. The N-terminal region of rAxin, residues 89–216, shared 31% amino acid identity with residues 58–178 of RGS4, which has been identified as a GTPase-activating protein (GAP) for heterotrimeric GTP-binding protein (G protein) (Druey et al., 1996) (Figure 1B and C). The C-terminal region, residues 757–820, shared 37% amino acid identity with residues 8–73 of the mouse Dsh homolog, DVL-1 (Sussman et al., 1994) (Figure 1B and C). A single band of 4.8 kb rAxin mRNA was detected ubiquitously in those rat tissues which we examined (Figure 1D). Figure 1.Structure of rAxin. (A) Amino acid sequence of rAxin. Identical residues in rat and mouse Axin are denoted by a black background. The DDBJ/EMBL/GenBank Accession no. of rAxin is AF017756. (B) Schematic representation of rAxin. The RGS homologous domain, GSK-3β-binding site, β-catenin-binding site and Dsh homologous domain are indicated. (C) Alignment of the amino acid sequences of rAxin and RGS4 or mouse DVL-1. Sequences of rAxin and RGS4 or DVL-1 are aligned using the GENETYX-MAC program. Amino acid identity is highlighted in black. Black dots under RGS4 indicate 11 amino acid residues that make direct contact with Gi1α. (D) Northern blot analysis of rAxin. Total RNAs (20 μg/lane) of various rat tissues were probed with cDNA encoding rAxin-(1–131). The positions of 28S and 18S rRNAs are indicated. The arrowhead indicates the positions of rAxin mRNA. The results shown are representative of two independent experiments. Download figure Download PowerPoint Interaction of rAxin with GSK-3β To examine whether rAxin interacts with GSK-3β in intact cells, we co-expressed rAxin with GSK-3β in COS cells (Figure 2A). rAxin and GSK-3β were tagged with Myc and hemagglutinin 1 (HA) epitopes, respectively, at their N-termini. HA-GSK-3β and endogenous GSK-3β were detected by the anti-GSK-3β antibody. When the lysates co-expressing Myc-rAxin with HA-GSK-3β were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, HA-GSK-3β was detected in the Myc-rAxin immune complex (Figure 2B, lanes 1–3). Similarly, when the same lysates were immunoprecipitated with the anti-HA antibody, Myc-rAxin was detected in the HA-GSK-3β immune complex (Figure 2B, lanes 4–6). Neither Myc-rAxin nor HA-GSK-3β was immunoprecipitated from the lysates expressing both proteins with non-immune immunoglobulin (data not shown). To show that Myc-rAxin interacts with endogenous GSK-3α and GSK-3β, the lysates expressing Myc-rAxin alone were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody. Endogenous GSK-3α and GSK-3β were co-precipitated with Myc-rAxin (Figure 2C). These results suggest that rAxin forms a complex with GSK-3α and GSK-3β in intact cells. HA-GSK-3βK85M and HA-GSK-3βY216F, in which ATP binding and tyrosine phosphorylation sites respectively are mutated, were expressed in COS cells. Neither HA-GSK-3βK85M nor HA-GSK-3βY216F showed kinase activities for GSK peptide 1 (data not shown). Co-transfection of Myc-rAxin with these HA-GSK-3β mutants did not alter the level of expression of transfected Myc-rAxin as assessed by immunoblot analysis (data not shown). When these lysates were immunoprecipitated with the anti-HA antibody, Myc-rAxin was not co-precipitated with HA-GSK-3βK85M or HA-GSK-3βY216F (Figure 2D). These results suggest that the kinase activity of GSK-3β may be necessary for its complex formation with rAxin. Figure 2.Interaction of rAxin with GSK-3β in intact cells. (A) Expression in COS cells. The lysates (20 μg of protein) expressing both Myc-rAxin and HA-GSK-3β (lane 2), Myc-rAxin alone (lane 3) and HA-GSK-3β alone (lane 4) were probed with the anti-Myc and GSK-3β antibodies. The lysates of COS cells transfected with empty vectors were used as controls (lane 1). (B) Interaction of rAxin with GSK-3β in COS cells. The same lysates (160 μg of protein) of COS cells prepared in (A) were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody (lanes 1–3) or the anti-HA antibody (lanes 4–6). The immunoprecipitates were probed with the anti-Myc and HA antibodies. (C) Interaction of rAxin with endogenous GSK-3α and GSK-3β. The lysates expressing Myc-rAxin (lanes 2 and 4) were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody. The immunoprecipitates were probed with the anti-Myc, GSK-3α and GSK-3β antibodies. The lysates of COS cells transfected with empty vectors were used as controls (lanes 1 and 3). (D) Requirement for kinase activity of GSK-3β for its interaction with rAxin. Myc-rAxin was co-expressed with wild-type HA-GSK-3β (lane 1), HA-GSK-3βK85M (lane 2) or HA-GSK-3βY216F (lane 3) in COS cells, and the lysates (160 μg of protein) were immunoprecipitated with the anti-HA antibody. The precipitates were probed with the anti-Myc and HA antibodies. IP, immunoprecipitation; Ab, antibody; Ig, immunoglobulin; WT, wild-type HA-GSK-3β; 85M, HA-GSK-3βK85M; 216F, HA-GSK-3βY216F. The large arrows, large arrowheads, small arrowheads and small arrow indicate the positions of Myc-rAxin, HA-GSK-3β and its mutants, endogenous GSK-3β and endogenous GSK-3α, respectively. The results shown are representative of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint To determine which region of rAxin interacts with GSK-3β, various deletion mutants of Myc-rAxin were expressed in COS cells (Figure 3A and B, upper panel). When the lysates expressing Myc-rAxin mutants were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, endogenous GSK-3β was co-precipitated with Myc-rAxin (full-length), Myc-rAxin-(298–832), Myc-rAxin-(1–713), Myc-rAxin-(298–713) and Myc-rAxin-(298–506), but not with Myc-rAxin-(508–832), Myc-rAxin-(713–832) or Myc-rAxin-(1–229) (Figure 3B, lower panel). These results indicate that the region containing residues 298–506 of rAxin is sufficient and necessary for its complex formation with GSK-3β. Figure 3.Interacting domain of rAxin with GSK-3β. (A) Deletion mutants of rAxin. The hatched and white boxes indicate the RGS homologous and Dsh homologous domains, respectively. (B) Expression of rAxin deletion mutants and their interaction with GSK-3β. The lysates of COS cells expressing Myc-rAxin (full-length) (lane 1), Myc-rAxin-(298–832) (lane 2), Myc-rAxin-(508–832) (lane 3), Myc-rAxin-(713–832) (lane 4), Myc-rAxin-(1–229) (lane 5), Myc-rAxin-(1–713) (lane 6), Myc-rAxin-(298–713) (lane 7) and Myc-rAxin-(298–506) (lane 8) were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, then the precipitates were probed with the anti-Myc antibody (upper panel) or the anti-GSK-3β antibody (lower panel). IP, immunoprecipitation; Ab, antibody; Ig, immunoglobulin. The arrowhead indicates the position of endogenous GSK-3β. The results shown are representative of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint Phosphorylation of rAxin by GSK-3β To determine whether rAxin is a substrate for GSK-3β, Myc-rAxin immunoprecipitated from the COS cell lysates was incubated with or without glutathione S-transferase (GST) fused to GSK-3β (GST–GSK-3β). rAxin was phosphorylated without GST–GSK-3β, and this phosphorylation was enhanced by GST–GSK-3β (Figure 4A). GST–GSK-3β phosphorylated Myc-rAxin in a time- and dose-dependent manner (Figure 4B and C). Approximately 3–4 mol of phosphate was maximally incorporated into 1 mol of Myc-rAxin. In Figure 2C, we show that endogenous GSK-3β is co-precipitated with Myc-rAxin. Therefore, the phosphorylation of Myc-rAxin without GST–GSK-3β might be due to the associated endogenous GSK-3β. However, we cannot rule out the possibility that GSK-3β phosphorylates and activates other protein kinases which interact with and phosphorylate Myc-rAxin. Alternatively, other protein kinases associated with Myc-rAxin might phosphorylate it independently of GSK-3β. Figure 4.Phosphorylation of rAxin by GSK-3β. (A) Autoradiography. Myc-rAxin (full-length) immunoprecipitated from the COS cell lysates (100 μg of protein) was incubated with (lane 2) or without (lane 1) GST–GSK-3β (100 ng of protein) for 10 min, then the samples were subjected to SDS–PAGE followed by autoradiography. The arrowhead and arrow indicate the positions of Myc-rAxin and GST–GSK-3β, respectively. (B) Time course. Myc-rAxin immunoprecipitated from the COS cell lysates was incubated with (●) or without (○) GST–GSK-3β (100 ng of protein) for the indicated periods of time. The radioactivity of the phosphorylated Myc-rAxin was counted. (C) Dose dependency. Myc-rAxin immunoprecipitated from the COS cell lysates was incubated with the indicated amounts of GST–GSK-3β for 5 min. (D) Phosphorylation of rAxin mutants by GSK-3β. Myc-rAxin (full-length) (lane 1), Myc-rAxin-(298–832) (lane 2), Myc-rAxin-(508–832) (lane 3), Myc-rAxin-(713–832) (lane 4), Myc-rAxin-(1–229) (lane 5), Myc-rAxin-(1–713) (lane 6), Myc-rAxin-(298–713) (lane 7) and Myc-rAxin-(298–506) (lane 8) immunoprecipitated from the COS cell lysates were incubated with GST–GSK-3β (100 ng of protein) for 30 min. (E) Co-precipitation of endogenous Axin with GSK-3β. The lysates (200 μg of protein) of COS cells (lanes 2 and 3) were immunoprecipitated with the anti-GSK-3β antibody (lane 2) or non-immune immunoglobulin (lane 3). The immunoprecipitates were incubated in the kinase reaction mixture. The lysates of COS cells expressing Myc-rAxin (lane 1) were used to determine the position of the phosphorylated Myc-rAxin. IP, immunoprecipitation; Ab, antibody; NI; non-immune immunoglobulin. (F) Phosphorylation sites of rAxin for GSK-3β. MBP–rAxin-(298–506) (lane 2), MBP–rAxin-(298–506, 322/326/330A) (lane 3), MBP–rAxin-(298–506, 333/337/341A) (lane 4) and MBP–rAxin-(298–506, 339/343A) (lane 5) (375 ng of protein each) were incubated with GST–GSK-3β (100 ng of protein) for 15 min. As a control, MBP–rAxin-(298–506) was incubated without GST–GSK-3β (lane 1). WT, MBP–rAxin-(298–506). The arrowhead indicates the positions of MBP–rAxin-(298–506) and its mutants. The results shown are representative of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint To determine which regions of rAxin were phosphorylated by GSK-3β, various deletion mutants of Myc-rAxin described in Figure 3A were immunoprecipitated from the COS cell lysates. Myc-rAxin (full-length), Myc-rAxin-(298–832), Myc-rAxin-(1–713), Myc-rAxin-(298–713) and Myc-rAxin-(298–506) were phosphorylated by GST–GSK-3β (Figure 4D, lanes 1, 2 and 6–8); however, Myc-rAxin-(508–832), Myc-rAxin-(713–832) and Myc-rAxin-(1–229) were not (lanes 3–5). These results indicate that Myc-rAxin-(298–506) contains at least one phosphorylation site for GSK-3β. Taken together with the observations in Figure 3, the physical interaction of rAxin with GSK-3β may be required for the phosphorylation of rAxin. To examine whether endogenous Axin interacts with GSK-3β in intact cells, the COS cell lysates were immunoprecipitated with the anti-GSK-3β antibody, and the immunoprecipitates were incubated in the kinase reaction mixture. The protein with an Mr of 105 kDa, which is similar to the Mr of Myc-rAxin, was phosphorylated, but this phosphorylated protein was not observed in the immunoprecipitates with non-immune immunoglobulin (Figure 4E). These results suggest that endogenous Axin forms a complex with and is phosphorylated by GSK-3β. Kinetics of the phosphorylation of rAxin-(298–506) by GSK-3β and the interaction of rAxin-(298–506) with GSK-3β To rule out the involvement of endogenous GSK-3β in the phosphorylation of and interaction with rAxin, we purified rAxin-(298–506) from Escherichia coli as a maltose-binding protein (MBP) fusion protein. GST–GSK-3β phosphorylated MBP–rAxin-(298–506) in a time-dependent manner (Figures 4F and 5A). The Km value for the phosphorylation of MBP–rAxin-(298–506) by GST–GSK-3β was calculated to be 93 nM. The sequence S/TXXXS/T is known to be a consensus sequence for a GSK-3β phosphorylation site (Plyte et al., 1992). In residues 298–506 of rAxin, there are three possible phosphorylation sites: SANDSEQQS330, SDADTLSLT341 and SLTDS343. All serine and threonine residues of these possible phosphorylation sites were substituted by alanine, and the phosphorylation of these mutants by GST–GSK-3β was examined. The phosphorylation levels of MBP–rAxin-(298–506, 322/326/330A), MBP–rAxin-(298–506, 333/337/341A) and MBP–rAxin-(298–506, 339/343A) by GST–GSK-3β were reduced to 55–60% of wild-type (Figure 4F). These results indicate that rAxin is directly phosphorylated by GSK-3β and that it has multiple phosphorylation sites for GSK-3β. Figure 5.Kinetics of the phosphorylation of rAxin-(298–506) by GSK-3β and the interaction of rAxin-(298–506) with GSK-3β. (A) Direct phosphorylation of rAxin-(298–506) by GSK-3β. MBP–rAxin-(298–506) (1 μg of protein) was incubated with (●) or without (○) GST–GSK-3β (100 ng of protein) for the indicated time. (B) Direct binding of rAxin-(298–506) to GSK-3β. GST–GSK-3β (●), GST–GSK-3βK85M (○) and GST–GSK-3βY216F (▵) (2.2 pmol each) immobilized to glutathione–Sepharose 4B were incubated with the indicated concentrations of MBP–rAxin-(298–506) for 2 h. After GST–GSK-3β and its mutants were precipitated by centrifugation, the precipitates were probed with the anti-MBP antibody and the amounts of interacted MBP–rAxin-(298–506) were quantified by densitometric tracing. The results shown are representative of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint MBP–rAxin-(298–506) bound to GST–GSK-3β in a dose-dependent manner, and the Kd value of the binding was ∼65 nM (Figure 5B). These results indicate that rAxin directly interacts with GSK-3β. Neither GST–GSK-3βK85M nor GST–GSK-3βY216F exhibited kinase activities for GSK peptide 1 (data not shown). Consistent with the results in Figure 2D, MBP–rAxin-(298–506) did not bind to these GSK-3β mutants (Figure 5B). Since ATP was not used in this experiment, it is suggested that the interaction of rAxin with GSK-3β does not require the phosphorylation of rAxin but that the interaction may require the structure of GSK-3β which is catalytically active. Interaction of rAxin with β-catenin It has been demonstrated that Axin negatively regulates the Wnt signaling pathway either at the level of GSK-3 or further downstream of GSK-3, and that it acts upstream of β-catenin (Zeng et al., 1997). Therefore, we next examined the relationship between rAxin and β-catenin. β-Catenin was expressed in COS cells (Figure 6A). When the lysates expressing Myc-rAxin were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, endogenous β-catenin was co-precipitated with Myc-rAxin (Figure 6A). Neither Myc-rAxin nor β-catenin were immunoprecipitated from the lysates expressing Myc-rAxin with non-immune immunoglobulin (data not shown). Myc-rAxin was co-precipitated with GST–β-catenin-(1–423) but not with GST–β-catenin-(423–781) from the COS cell lysates (Figure 6B). These results suggest that rAxin forms a complex with the N-terminal region of β-catenin in intact cells. To determine which region of rAxin binds to β-catenin, various deletion mutants of Myc-rAxin described in Figure 3A were expressed in COS cells, and the lysates were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody. Endogenous β-catenin was co-precipitated with Myc-rAxin (full-length), Myc-rAxin-(298–832), Myc-rAxin-(1–713), Myc-rAxin-(298–713) and Myc-rAxin-(298–506), but not with Myc-rAxin-(508–832), Myc-rAxin-(713–832) or Myc-rAxin-(1–229) (Figure 6C). These results indicate that the region containing residues 298–506 of rAxin is sufficient and necessary for it to form a complex with β-catenin. To examine whether β-catenin directly binds to rAxin and which region of β-catenin is involved in this binding, various deletion mutants of β-catenin were purified from E.coli as GST fusion proteins. GST–β-catenin-(1–423), GST–β-catenin-(132–423) and GST–β-catenin-(175–423), but not GST–β-catenin-(1–131) or GST–β-catenin-(423–781), bound to MBP–rAxin-(298–506) (Figure 6D). GST–β-catenin-(132–423) contains seven armadillo repeats, and β-catenin-(175–423) lacks the first armadillo repeat. The N-terminal region containing the first armadillo repeat of β-catenin is known to be involved in its interaction with α-catenin (Hülsken et al., 1994; Funayama et al., 1995). Therefore, these results demonstrate that rAxin directly interacts with the armadillo repeats 2–7 of β-catenin and that it does not compete with α-catenin for binding to β-catenin. The interaction of rAxin with β-catenin was confirmed by the yeast two-hybrid method (Table I). Figure 6.Interaction of rAxin with β-catenin. (A) Interaction of rAxin with β-catenin in intact cells. The lysates (20 μg of protein) of COS cells expressing Myc-rAxin (lanes 1 and 3) or control cells (lanes 2 and 4) were probed with the anti-Myc and β-catenin antibodies (lanes 1 and 2), and the same lysates (200 μg of protein) were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, then probed with the anti-Myc and β-catenin antibodies (lanes 3 and 4). (B) Interaction of the N-terminal region of β-catenin with rAxin. GST–β-catenin (lane 1), GST–β-catenin-(1–423) (lane 2) and GST–β-catenin-(423–781) (lane 3) (9 pmol each) were subjected to SDS–PAGE followed by Coomassie Brilliant Blue staining. After the lysates (200 μg of protein) of COS cells expressing Myc-rAxin were incubated with GST–β-catenin (lane 4), GST–β-catenin-(1–423) (lane 5) and GST–β-catenin-(423–781) (lane 6) (18 pmol each), GST–β-catenin and its deletion mutants were precipitated with glutathione–Sepharose 4B. The precipitates were probed with the anti-Myc antibody. (C) Interacting domain of rAxin with β-catenin. After the lysates of COS ce

Neurons are highly polarized and comprised of two structurally and functionally distinct parts, an axon and dendrites. We previously showed that collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2) is critical for specifying axon/dendrite fate, possibly by promoting neurite elongation via microtubule assembly. Here, we showed that glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) phosphorylated CRMP-2 at Thr-514 and inactivated it. The expression of the nonphosphorylated form of CRMP-2 or inhibition of GSK-3β induced the formation of multiple axon-like neurites in hippocampal neurons. The expression of constitutively active GSK-3β impaired neuronal polarization, whereas the nonphosphorylated form of CRMP-2 counteracted the inhibitory effects of GSK-3β, indicating that GSK-3β regulates neuronal polarity through the phosphorylation of CRMP-2. Treatment of hippocampal neurons with neurotrophin-3 (NT-3) induced inactivation of GSK-3β and dephosphorylation of CRMP-2. Knockdown of CRMP-2 inhibited NT-3-induced axon outgrowth. These results suggest that NT-3 decreases phosphorylated CRMP-2 and increases nonphosphorylated active CRMP-2, thereby promoting axon outgrowth.

Article4 May 1999free access An F-box protein, FWD1, mediates ubiquitin-dependent proteolysis of β-catenin Masatoshi Kitagawa Masatoshi Kitagawa Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Shigetsugu Hatakeyama Shigetsugu Hatakeyama Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Michiko Shirane Michiko Shirane Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Masaki Matsumoto Masaki Matsumoto Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Noriko Ishida Noriko Ishida Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Kimihiko Hattori Kimihiko Hattori Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Ikuo Nakamichi Ikuo Nakamichi Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Akira Kikuchi Akira Kikuchi First Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-0037 Japan Search for more papers by this author Kei-ichi Nakayama Corresponding Author Kei-ichi Nakayama Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Laboratory of Embryonic and Genetic Engineering, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan Search for more papers by this author Keiko Nakayama Keiko Nakayama CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Laboratory of Embryonic and Genetic Engineering, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan Search for more papers by this author Masatoshi Kitagawa Masatoshi Kitagawa Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Shigetsugu Hatakeyama Shigetsugu Hatakeyama Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Michiko Shirane Michiko Shirane Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Masaki Matsumoto Masaki Matsumoto Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Noriko Ishida Noriko Ishida Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Kimihiko Hattori Kimihiko Hattori Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Ikuo Nakamichi Ikuo Nakamichi Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Search for more papers by this author Akira Kikuchi Akira Kikuchi First Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-0037 Japan Search for more papers by this author Kei-ichi Nakayama Corresponding Author Kei-ichi Nakayama Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Laboratory of Embryonic and Genetic Engineering, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan Search for more papers by this author Keiko Nakayama Keiko Nakayama CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan Laboratory of Embryonic and Genetic Engineering, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan Search for more papers by this author Author Information Masatoshi Kitagawa1,2,‡, Shigetsugu Hatakeyama1,2,‡, Michiko Shirane1,2, Masaki Matsumoto1,2, Noriko Ishida1,2, Kimihiko Hattori1,2, Ikuo Nakamichi1,2, Akira Kikuchi3, Kei-ichi Nakayama 1,2,4 and Keiko Nakayama2,4 1Department of Molecular and Cellular Biology, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan 2CREST, Japan Science and Technology Corporation (JST), 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012 Japan 3First Department of Biochemistry, Hiroshima University School of Medicine, 1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-0037 Japan 4Laboratory of Embryonic and Genetic Engineering, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka, 812-8582 Japan ‡M.Kitagawa and S.Hatakeyama contributed equally to this work *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (1999)18:2401-2410https://doi.org/10.1093/emboj/18.9.2401 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info β-catenin plays an essential role in the Wingless/Wnt signaling cascade and is a component of the cadherin cell adhesion complex. Deregulation of β-catenin accumulation as a result of mutations in adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor protein is believed to initiate colorectal neoplasia. β-catenin levels are regulated by the ubiquitin-dependent proteolysis system and β-catenin ubiquitination is preceded by phosphorylation of its N-terminal region by the glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)/Axin kinase complex. Here we show that FWD1 (the mouse homologue of Slimb/βTrCP), an F-box/WD40-repeat protein, specifically formed a multi-molecular complex with β-catenin, Axin, GSK-3β and APC. Mutations at the signal-induced phosphorylation site of β-catenin inhibited its association with FWD1. FWD1 facilitated ubiquitination and promoted degradation of β-catenin, resulting in reduced cytoplasmic β-catenin levels. In contrast, a dominant-negative mutant form of FWD1 inhibited the ubiquitination process and stabilized β-catenin. These results suggest that the Skp1/Cullin/F-box protein FWD1 (SCFFWD1)–ubiquitin ligase complex is involved in β-catenin ubiquitination and that FWD1 serves as an intracellular receptor for phosphorylated β-catenin. FWD1 also links the phosphorylation machinery to the ubiquitin–proteasome pathway to ensure prompt and efficient proteolysis of β-catenin in response to external signals. SCFFWD1 may be critical for tumor development and suppression through regulation of β-catenin protein stability. Introduction The Wingless/Wnt pathway is critical for development and organogenesis (Huber et al., 1996b; Miller and Moon, 1996; Cadigan and Nusse, 1997). Cytoplasmic β-catenin plays an essential role in Wnt signaling and membrane-associated β-catenin serves as a lining protein for the cadherin cell adhesion complex (Aberle et al., 1996). In this pathway, which starts with Wnt, inactivation of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) leads to stabilization and accumulation of hypo-phosphorylated β-catenin, which then interacts with and activates T cell factor/lymphocyte enhancer binding factor (TCF/LEF) transcription factors (Huber et al., 1996a; Clevers and Vandewetering, 1997; Bauer et al., 1998). In the absence of the Wnt signal, GSK-3β constitutively phosphorylates β-catenin, leading to low expression levels as a result of ubiquitin-mediated proteolysis of β-catenin. Regulation of cytoplasmic β-catenin levels is clinically important, because deregulation of this system may play a critical role in the pathogenesis of colorectal cancer. Mutations of the adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor gene are the most common genetic events in colorectal cancers and one of the molecular functions of the APC protein is to bind β-catenin to GSK-3β, making it a target for destruction (Ilyas and Tomlinson, 1997; Korinek et al., 1997; Peifer, 1997). Colorectal tumors with intact APC genes, as well as melanoma cell lines, contain β-catenin mutations which functionally alter significant phosphorylation sites, and such alterations have been implicated in making β-catenin stable (Morin et al., 1997; Rubinfeld et al., 1997). GSK-3β, in concert with Axin, which associates with GSK-3β (Ikeda et al., 1998), appears to phosphorylate β-catenin at these sites. Axin also interacts directly with APC, suggesting that Axin functions as a scaffold protein for the assembly of the molecules that regulate β-catenin stability (Kishida et al., 1998). A recent study showed that β-catenin is a target for the ubiquitin–proteasome pathway and that phosphorylation of serine/threonine residues at positions 29, 33, 37, 41 and 45 by GSK-3β appears to be a prerequisite for ubiquitination (Aberle et al., 1997; Orford et al., 1997). These findings suggest that the abnormal accumulation of β-catenin resulting from deregulation of the proteolytic machinery via phosphorylation/ubiquitination is the most likely cause of tumorigenesis in colorectal cancers. The molecular mechanism by which β-catenin is specifically marked for degradation by ubiquitination in response to phosphorylation, however, is unclear. The ubiquitin–proteasome pathway plays a key role in diverse biological processes, such as cell proliferation, differentiation and development, and protein levels which are determined in a substrate-specific manner by this system (Hershko and Ciechanover, 1992; Weissman, 1997). The formation of ubiquitin–protein conjugates involves three components which participate in a cascade of ubiquitin-transfer reactions: a ubiquitin-activating enzyme (E1), a ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and a ubiquitin ligase (E3). The specificity of protein ubiquitination often derives from the latter and proteins polyubiquitinated by these enzymes are subject to degradation by the 26S proteasome. Recent genetic and biochemical studies on yeast have led to the identification of a novel class of E3 ligases (termed the Skp1/Cullin/F-box proteins, SCF complex) required for degradation of cyclins and their inhibitors. As well as cell-cycle-related proteins, an increasing number of molecules in other biological systems of yeast have been identified as substrates for the SCF–E3 complex, which consists of invariable components, such as Skp1 and Cdc53, and variable components called F-box proteins, which bind to Skp1 through the F-box motif (Elledge and Harper, 1998; Krek, 1998). F-box proteins serve as receptors for the target proteins, which are usually phosphorylated (Feldman et al., 1997; Skowyra et al., 1997). Thus, the substrate specificity of the SCF complex is believed to depend on F-box proteins. Although the physiological roles of the SCF complex in multicellular organisms have not been elucidated, a recent study showed that a mutation of the F-box/WD40-repeat protein Slimb in Drosophila led to accumulation of Armadillo, a β-catenin homologue (Jiang and Struhl, 1998). This genetic evidence prompted us to investigate whether the mammalian homologue of Slimb is involved in β-catenin degradation. In this study, we isolated FWD1, an F-box/WD40-repeat protein, as a mouse homologue of Drosophila Slimb, and demonstrated that FWD1 associated with β-catenin/Axin/GSK-3β/APC and promoted β-catenin ubiquitination and degradation. The biological roles of FWD1 and its involvement in cancer are discussed. Results Association of FWD1 with β-catenin and Axin We searched a mouse expression sequence tag (EST) database for DNA sequences homologous with the genes for Drosophila Slimb and identified a clone showing significant homology with Slimb. Full-length DNA sequencing revealed that this clone encodes a protein with features of an F-box domain followed by seven WD40 repeats (Hatakeyama et al., 1999). This clone, designated FWD1 (F-box/WD40-repeat protein 1) is very similar to Slimb (Drosophila melanogaster), βTrCP (Xenopus laevis) and h-βTrCP (Homo sapiens) (Spevak et al., 1993; Jiang and Struhl, 1998; Margottin et al., 1998; Hatakeyama et al., 1999). Such prominent evolutionary conservation of FWD1 implies that it is biologically important. Recently, we demonstrated that FWD1 forms an SCF complex with Skp1 and Cul1 (referred to as SCFFWD1), and that SCFFWD1 functions as a ubiquitin ligase for IκBα, which partially shares homology with β-catenin around the signal-induced phosphorylation site (Hatakeyama et al., 1999). To determine whether FWD1 associated with β-catenin, Flag-tagged FWD1 with or without Myc-tagged Axin were transfected into 293T cells, and co-immunoprecipitation assays were performed (Figure 1A). Very little β-catenin was detected in the FWD1 immunoprecipitate, but the association of FWD1 and β-catenin was significantly augmented by the co-introduction of Axin, which interacts with β-catenin, GSK-3β and APC (Ikeda et al., 1998; Kishida et al., 1998) (Figure 1A, lanes 3 and 4). The slight association between FWD1 and β-catenin without the introduction of Axin was probably due to the presence of endogenous Axin. FWD1 also associated with Axin (Figure 1A, lane 4). The negative control, p57Kip2, did not interact with β-catenin or Axin. This association of FWD1 with β-catenin and Axin was confirmed by reciprocal co-immunoprecipitation analysis with anti-β-catenin and anti-Myc (Axin) antibodies. FWD1 was detected in the immunoprecipitate with the anti-β-catenin antibody only when Axin was co-introduced (Figure 1B, lane 4). Axin was also present in this complex. Therefore, β-catenin and FWD1 did not interact efficiently in the absence of Axin. FWD1 and β-catenin co-immunoprecipitated with Axin (Figure 1B, lane 8), whereas β-catenin did not bind efficiently to Axin in the absence of FWD1 (Figure 1B, lanes 2 and 6). Taken together, these results indicate that FWD1, β-catenin and Axin form a ternary complex and that the lack of any component, at least in vivo, significantly reduces the stability of this complex. We used FWD2, another F-box/seven WD40-repeat protein from the mouse EST database which was previously identified as an F-box protein of unknown function, called MD6 (Bai et al., 1996) (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. X54352), as a negative control. FWD2 did not interact with β-catenin even when Axin was introduced (Figure 1B, lanes 2 and 6). Another F-box protein, Skp2, was also subjected to this assay, but it failed to interact with β-catenin or Axin (data not shown). These data suggest that the association between FWD1 and β-catenin is specific, but is not mediated by the F-box motif. Figure 1.Association of FWD1 with β-catenin and Axin in vivo. (A) The FWD1 immunoprecipitate contained β-catenin and Axin. Transfection of 293T cells was carried out with expression plasmids encoding Flag-p57 or Flag-FWD1 in combination with vector alone or Myc-Axin (indicated by the plus and minus signs at the top of each lane), the cell lysates were immunoprecipitated via the Flag-tag on p57 or FWD1, immunoblotted and probed with anti-β-catenin or anti-Myc antibodies to detect Axin. The bands represent β-catenin or Axin associated with p57 or FWD1. Ten percent of each input lysate was immunoblotted and probed with anti-β-catenin, anti-Myc or anti-Flag antibodies to show the expression levels of endogenous β-catenin, Myc-Axin and Flag-p57 or Flag-FWD1, respectively. The positions of β-catenin, Myc-Axin, Flag-p57 and Flag-FWD1 are indicated. The reasons why the amount of β-catenin as shown by the 10% input is not reduced when Axin and FWD1 are co-transfected are that transfected cells may be a small part of the total cells, and that only cytosolic β-catenin is degraded by FWD1/Axin while a substantial amount of membrane-associated β-catenin remains unaffected. (B) The β-catenin and Myc-Axin immunoprecipitates contained FWD1. Transfection of 293T cells were performed with expression plasmids encoding Flag-FWD1 or Flag-FWD2 in combination with vector alone or Myc-Axin (indicated by the plus and minus signs at the top of each lane), the cell lysates were immunoprecipitated with the β-catenin antibody (lanes 1–4) or via the Myc tag on Axin (lanes 5–8), immunoblotted and probed with anti-β-catenin antibody (top panels), anti-Myc antibody to detect Axin (middle panels) or anti-Flag antibody to detect FWD2 and FWD1 (bottom panels). Ten percent of each input lysate was immunoblotted and probed with anti-β-catenin, anti-Myc or anti-Flag antibodies to show the expression levels of endogenous β-catenin, Myc-Axin and Flag-FWD1 or Flag-FWD2, respectively (lanes 9–12). The positions of β-catenin, Myc-Axin, Flag-FWD1, and Flag-FWD2 are indicated. (C) In vitro binding assays. Recombinant β-catenin, Myc-Axin, and FWD1 produced in the baculoviral expression system were mixed in the combination as indicated. The reaction mixture was immunoprecipitated with anti-β-catenin antibody, immunoblotted and probed with anti-β-catenin (top), anti-Myc to detect Axin (middle) or anti-Flag antibody to detect FWD1 (bottom). TF, transfection; IP, immunoprecipitation; IB, immunoblotting. Download figure Download PowerPoint These in vivo results were confirmed by in vitro binding experiments. Consistent with the in vivo studies, β-catenin and FWD1 did not interact each other in the absence of Axin in vitro (Figure 1C, lane 2). The amount of FWD1 associated with β-catenin increased in proportion to the Axin level (lanes 3–5), suggesting that FWD1 requires Axin to interact with β-catenin. In contrast to the in vivo data, however, β-catenin associated with Axin in vitro in the absence of FWD1 (lane 6). This discrepancy between in vivo and in vitro experiments may possibly be explained by the extra physiological amount of proteins in the in vitro setting which may have resulted in non-specific binding, or that β-catenin and Axin might be spatially separated in vivo, and FWD1 may link β-catenin to Axin as a docking molecule. Moreover, a phosphorylated synthetic peptide corresponding to the N-terminal region of β-catenin competitively inhibited the association of FWD1 with β-catenin in vitro without affecting the binding between Axin and β-catenin (see Figure 4C). This result indicates that FWD1 binds directly to β-catenin with the aid of Axin. Axin probably serves as a scaffold protein linking β-catenin and GSK-3β to phosphorylate β-catenin. FWD1 barely interacted with Axin in the absence of β-catenin in vitro (data not shown). Mutations on the phosphorylation sites in β-catenin abrogated the binding between FWD1 and β-catenin (see below). We conclude from this data that FWD1 seems to be in immediate contact with phosphorylated β-catenin. In order to determine the region required for β-catenin/Axin complexation, the abilities of FWD1 mutants to form complexes with β-catenin/Axin were tested (Figure 2A). A mutant FWD1 lacking the WD40-repeats (ΔWD) did not associate with β-catenin or Axin, whereas the mutant FWD1(ΔF) from which the F-box domain had been removed complexed with β-catenin and Axin (Figure 2B). In contrast, the FWD1(ΔWD) mutant interacted with Skp1, whereas the FWD(ΔF) mutant did not (Hatakeyama et al., 1999). These results confirm that the F-box domain is essential for binding to Skp1, but not to β-catenin/Axin. A deletion mutant lacking the N-terminal region and F-box domain (ΔN/F) failed to associate with β-catenin/Axin (data not shown; the results are summarized in Figure 2A), suggesting that both the N-terminal region and WD40-repeat domain of FWD1 are necessary for complex formation with β-catenin/Axin. Figure 2.Determination of the interacting regions of FWD1 and β-catenin. (A) Schematic representation of FWD1 deletion mutants. The hatched and white boxes indicate the F-box domain and WD40-repeats, respectively, and the interactions with β-catenin/Axin and Skp1 are summarized (indicated by plus and minus signs). (B) FWD1 deletion mutant expression and interactions with β-catenin and Axin. Wild-type FWD1/2 and all the deletion mutants were tagged with the Flag epitope at their N-termini and lysates of 293T cells expressing FWD2 (lane 1), wild-type FWD1 (lane 2), FWD1(ΔF/WD) (lane 3), FWD1(ΔWD) (lane 4), FWD1(ΔN/F) (lane 5), FWD1(ΔF) (lane 6), and Myc-Axin (all lanes) were immunoprecipitated with the anti-Flag antibody, immunoblotted and probed with anti-β-catenin, anti-Myc, or anti-Flag antibodies. Ten percent of each input lysate was immunoblotted and probed with the anti-β-catenin or anti-Myc antibody to show the expression levels of endogenous β-catenin and Myc-Axin, respectively. The positions of β-catenin, Myc-Axin and the Flag-FWD1 mutants are indicated. (C) FWD1 did not associate with SA mutant β-catenin. Transfection of 293T cells were carried out with expression plasmids encoding Myc-Axin, Flag-FWD2 and Flag-FWD1 (indicated by the plus and minus signs at the top of each lane) in combination with wild-type β-catenin-Myc (indicated as WT) or SA mutant β-catenin-Myc (indicated as SA). Cell lysates were immunoprecipitated via the Flag-tag on FWD2 or FWD1 (lanes 1–8), immunoblotted and probed with the anti-Myc antibody to detect β-catenin and Axin (upper) or with the anti-Flag antibody to detect FWD2 and FWD1 (lower). Ten percent of each input lysate was immunoblotted and probed with anti-Myc and anti-Flag antibodies to show the expression levels of β-catenin-Myc/Myc-Axin and Flag-FWD1/Flag-FWD2, respectively (lanes 9–16). The positions of β-catenin-Myc, Myc-Axin, Flag-FWD1 and Flag-FWD2 are indicated. TF, transfection; IP, immunoprecipitation; IB, immunoblotting. Download figure Download PowerPoint Previous studies and our unpublished data suggest that ubiquitin-mediated degradation of β-catenin is largely dependent on the phosphorylation of serine/threonine residues at positions 29, 33, 37, 41 and 45 (Aberle et al., 1997; Orford et al., 1997). In order to establish whether phosphorylation is important for complex formation, the association between FWD1 and SA mutant β-catenin, in which the all five serine/threonine residues were replaced with alanine, was examined. The SA mutant β-catenin associated with neither FWD1 nor Axin (Figure 2C). Thus, formation of the trimolecular complex is dependent on phosphorylation of the serine/threonine residues at positions 29, 33, 37, 41 and 45 of β-catenin by the GSK-3β/Axin complex. Furthermore, the association of FWD1 with β-catenin was blocked by a phosphorylated synthetic peptide corresponding to the N-terminal region of β-catenin, whereas an unphosphorylated peptide was unable to inhibit it (see Figure 4C). These results indicate that FWD1 binds exclusively to the phosphorylated β-catenin. Interaction of FWD1 with GSK-3β and APC In previous studies, we demonstrated that Axin interacted directly with GSK-3β and APC (Ikeda et al., 1998; Kishida et al., 1998). Therefore, we examined whether FWD1 formed a complex with GSK-3β and APC through Axin. Hemagglutinin (HA)-tagged GSK-3β expressed in 293T cells with Myc-tagged Axin and Flag-tagged FWD1 or FWD2 was immunoprecipitated with anti-HA antibody (Figure 3A). Axin and GSK-3β were co-immunoprecipitated together regardless of the presence of FWD1. The interaction between FWD1 and GSK-3β was probably mediated through Axin. It is noteworthy that GSK-3β bound to β-catenin only when FWD1 was co-transfected (Figure 3A, lane 2). Similarly, the FWD1 immunoprecipitate contained APC and Axin (Figure 3B, lane 3) and the Axin immunoprecipitate contained APC and FWD1 (Figure 3B, lane 6). The association between FWD1 and APC required Axin, because APC was not detected in the FWD1 immunoprecipitate when Axin was not co-transfected (Figure 3B, lane 1). In contrast, Axin and APC formed a complex in the absence of FWD1 (Figure 3B, lane 5). Again, FWD2 interacted with neither GSK-3β nor APC, indicating that FWD1 associated specifically with GSK-3β and APC. Collectively, these data suggest that the Axin/GSK-3β/APC is complexed constitutively, whereas the interaction of β-catenin with Axin/GSK-3β/APC is dependent on FWD1. Figure 3.Association of FWD1 with GSK-3β and APC in vivo. (A) The GSK-3β immunoprecipitate contained FWD1, β-catenin and Axin. Transfection of 293T cells were carried out with expression plasmids encoding Flag-FWD1 (lanes 2 and 4) or Flag-FWD2 (lanes 1 and 3) in combination with Myc-Axin and HA-GSK-3β (every lane), the cell lysates were immunoprecipitated via the HA-tag on GSK-3β (lanes 1 and 2), immunoblotted and probed with the anti-Flag antibody to detect FWD1 and FWD2, anti-Myc antidody to detect Axin or the anti-β-catenin or anti-HA antibody to detect GSK-3β. The bands represent FWD1, β-catenin or Axin associated with GSK-3β. Ten percent of each input lysate was immunoblotted and probed to show the expression levels of Flag-FWD1, Flag-FWD2, Myc-Axin, endogenous β-catenin and HA-GSK-3β (lanes 3 and 4). The positions of Flag-FWD1 and Flag-FWD2, Myc-Axin, β-catenin and HA- GSK-3β are indicated. (B) The FWD1 and Axin immunoprecipitates contained APC. Transfection of 293T cells were performed with expression plasmids encoding Flag-FWD1 or Flag-FWD2 in combination with vector alone or Myc-Axin (indicated by the plus and minus signs at the top of each lane), the cell lysates were immuno- precipitated with the anti-Flag antibody on FWD1 or FWD2 (lanes 1–3) or the anti-Myc tag on Axin (lanes 4–6), immunoblotted and probed with anti-APC antibody (top panels), anti-Myc antibody to detect Axin (middle panels) or anti-Flag antibody to detect FWD1 and FWD2 (bottom panels). Ten percent of each input lysate was immunoblotted to show the expression levels of endogenous β-catenin, Myc-Axin, Flag-FWD1 and Flag-FWD2 (lanes 7–9). The positions of β-catenin, Myc-Axin, Flag-FWD1 and Flag-FWD2 are indicated. TF, transfection; IP, immunoprecipitation; IB, immunoblotting. Download figure Download PowerPoint Figure 4.Facilitation of β-catenin ubiquitination in vivo. (A) Promotion of β-catenin ubiquitination by FWD1. Transfection of 293T cells were performed with expression plasmids encoding Flag-FWD1 (lanes 2, 4 and 6) or Flag-FWD2 (lanes 1, 3 and 5), treated with control vehicle (dimethyl sulfoxide, DMSO; lanes 1 and 2), LLnL (lanes 3 and 4) or lactacystin (lanes 5 and 6), the cell lysates were immunoprecipitated with the anti- β-catenin antibody, immunoblotted and probed with the anti-ubiquitin antibody (top panel). Ten percent of each input lysate was immunoblotted and probed with the anti-β-catenin or anti-Flag antibody to show the expression levels of endogenous β-catenin, Flag-FWD1 and Flag-FWD2 (middle and bottom panels). (B) The F-box domain of FWD1 was required for β-catenin ubiquitination. Transfection of 293T cells were carried out with an expression plasmid encoding Flag-FWD2 (lane 1), Flag-FWD1 (lane 2) or Flag-FWD1(ΔF) (lane 3), the cell lysates were immunoprecipitated with the anti-β-catenin antibody, immunoblotted and probed with anti-ubiquitin antibody (top panel). Ten percent of each in

The regulators of G protein signaling (RGS) domain of Axin, a negative regulator of the Wnt signaling pathway, made a complex with full-length adenomatous polyposis coli (APC) in COS, 293, and L cells but not with truncated APC in SW480 or DLD-1 cells. The RGS domain directly interacted with the region containing the 20-amino acid repeats but not with that containing the 15-amino acid repeats of APC, although both regions are known to bind to β-catenin. In the region containing seven 20-amino acid repeats, the region containing the latter five repeats bound to the RGS domain of Axin. Axin and β-catenin simultaneously interacted with APC. Furthermore, Axin stimulated the degradation of β-catenin in COS cells. Taken together with our recent observations that Axin directly interacts with glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and β-catenin and that it promotes GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin, these results suggest that Axin, APC, GSK-3β, and β-catenin make a tetrameric complex, resulting in the regulation of the stabilization of β-catenin. The regulators of G protein signaling (RGS) domain of Axin, a negative regulator of the Wnt signaling pathway, made a complex with full-length adenomatous polyposis coli (APC) in COS, 293, and L cells but not with truncated APC in SW480 or DLD-1 cells. The RGS domain directly interacted with the region containing the 20-amino acid repeats but not with that containing the 15-amino acid repeats of APC, although both regions are known to bind to β-catenin. In the region containing seven 20-amino acid repeats, the region containing the latter five repeats bound to the RGS domain of Axin. Axin and β-catenin simultaneously interacted with APC. Furthermore, Axin stimulated the degradation of β-catenin in COS cells. Taken together with our recent observations that Axin directly interacts with glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and β-catenin and that it promotes GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin, these results suggest that Axin, APC, GSK-3β, and β-catenin make a tetrameric complex, resulting in the regulation of the stabilization of β-catenin. Axin, which is a product of the mouse Fused locus, has been identified as a negative regulator of the Wnt signaling pathway (1Zeng L. Fagotto F. Zhang T. Hsu W. Vasicek T.J. Perry III W.L. Lee J.J. Tilghman S.M. Gumbiner B.M. Costantini F. Cell. 1997; 90: 181-192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (793) Google Scholar). Fused is a mutation that causes dominant skeletal and neurological defects and recessive lethal embryonic defects including neuroectodermal abnormalities (2Reed S.C. Genetics. 1937; 22: 1-13Crossref PubMed Google Scholar, 3Gluecksohn-Schoenheimer S. J. Exp. Zool. 1949; 110: 47-76Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar, 4Jacobs-Cohen R.J. Spiegelman M. Cookingham J.C. Bennett D. Genet. Res. 1984; 43: 43-50Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Because dorsal injection of wild type Axin in Xenopus embryos blocks axis formation and coinjection of Axin inhibits Wnt8-, Dsh-, and kinase-negative GSK-3β 1The abbreviations used are: GSK-3β, glycogen synthase kinase-3β; APC, adenomatous polyposis coli; FAP, familial adenomatous polyposis; aa, amino acid(s); RGS, regulators of G protein signaling; G protein, GTP-binding protein; GST, glutathioneS-transferase; MBP, maltose-binding protein; HA, hemagglutinin. -induced axis duplication (1Zeng L. Fagotto F. Zhang T. Hsu W. Vasicek T.J. Perry III W.L. Lee J.J. Tilghman S.M. Gumbiner B.M. Costantini F. Cell. 1997; 90: 181-192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (793) Google Scholar), Axin could exert its effects on axis formation by inhibiting the Wnt signaling pathway. However, the molecular mechanism by which Axin regulates axis formation has not been shown. We have recently identified rat Axin (rAxin) as a GSK-3β-interacting protein (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). rAxin is phosphorylated by GSK-3β, directly binds to not only GSK-3β but also β-catenin, and promotes GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). Because the phosphorylation of β-catenin by GSK-3β is essential for the down-regulation of β-catenin (6Miller J.R. Moon R.T. Genes Dev. 1996; 10: 2527-2539Crossref PubMed Scopus (607) Google Scholar, 7Yost C. Torres M. Miller J.R. Huang E. Kimelman D. Moon R.T. Genes Dev. 1996; 10: 1443-1454Crossref PubMed Scopus (1018) Google Scholar), our results suggest that rAxin may induce the degradation of β-catenin. These actions of rAxin are consistent with the observation that Axin inhibits dorsal axis formation in Xenopus embryos, because the accumulation of β-catenin induces the axis duplication (8Funayama N. Fagotto F. McCrea P. Gumbiner B.M. J. Cell Biol. 1995; 128: 959-968Crossref PubMed Scopus (500) Google Scholar). It has been shown that besides the phosphorylation by GSK-3β, the down-regulation of β-catenin requires APC, which is a tumor suppressor linked to FAP and to the initiation of sporadic human colorectal cancer (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar). The middle portion of APC contains three successive 15-amino acid (aa) repeats followed by seven related but distinct 20-aa repeats. Both types of repeats are able to bind independently to β-catenin (10Rubinfeld B. Souza B. Albert I. Müller O. Chamberlain S.H. Masiarz F.R. Munemitsu S. Polakis P. Science. 1993; 262: 1731-1734Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar, 11Su L. Vogelstein B. Kinzler K.W. Science. 1993; 262: 1734-1737Crossref PubMed Scopus (1115) Google Scholar, 12Rubinfeld B. Souza B. Albert I. Munemitsu S. Polakis P. J. Biol. Chem. 1995; 270: 5549-5555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (298) Google Scholar). In FAP and colorectal cancers, most patients carry APC mutations that result in the expression of truncated proteins (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar). Almost all mutant proteins lack the C-terminal half including most of the 20-aa repeats but retain the 15-aa repeats. Colorectal carcinoma cells with mutant APC contain large amounts of monomeric β-catenin (13Munemitsu S. Albert I. Souza B. Rubinfeld B. Polakis P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 3046-3050Crossref PubMed Scopus (955) Google Scholar). The accumulated β-catenin translocates to the nucleus, and this translocation involves the association of β-catenin with the transcription enhancers of the lymphocyte enhancer binding factor/T cell factor family (14Behrens J. von Kries J.P. Kühl M. Bruhn L. Wedlich D. Grosschedl R. Birchmeier W. Nature. 1996; 382: 638-642Crossref PubMed Scopus (2595) Google Scholar, 15Molenaar M. van de Wetering M. Oosterwegel M. Peterson-Maduro J. Godsave S. Korinek V. Roose J. Destrée O. Clevers H. Cell. 1996; 86: 391-399Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1618) Google Scholar). Because the APC mutants retain the β-catenin-binding activity, the interaction of APC with β-catenin is not sufficient for the down-regulation of β-catenin. How APC down-regulates β-catenin and the relationship between APC and Axin in the degradation of β-catenin are not clear. In addition to GSK-3β- and β-catenin-binding sites, rAxin has a domain that is homologous to RGS, and this domain is called the RGS domain (1Zeng L. Fagotto F. Zhang T. Hsu W. Vasicek T.J. Perry III W.L. Lee J.J. Tilghman S.M. Gumbiner B.M. Costantini F. Cell. 1997; 90: 181-192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (793) Google Scholar, 5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). RGS has been originally identified as a protein that binds to the GTP- but not GDP-bound form of Gα and stimulates GTP hydrolysis of Gα (16Dohlman H.G. Thorner J. J. Biol. Chem. 1997; 272: 3871-3874Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (450) Google Scholar). It has been shown that ΔRGS, a mutant of Axin in which the RGS domain is deleted, acts as a potent dorsalizer, producing a secondary axis and that Axin blocks the axis-inducing activity of ΔRGS (1Zeng L. Fagotto F. Zhang T. Hsu W. Vasicek T.J. Perry III W.L. Lee J.J. Tilghman S.M. Gumbiner B.M. Costantini F. Cell. 1997; 90: 181-192Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (793) Google Scholar). These results indicate that ΔRGS acts through a dominant-negative mechanism to inhibit an endogenous Axin activity and that it competes for binding to a protein with which Axin normally interacts. Therefore, the RGS domain may have an activity to transmit the signal by interacting with other protein(s). Here we report that the RGS domain of rAxin directly interacts with the region containing the 20-aa repeats of APC and that rAxin stimulates the down-regulation of β-catenin. Taken together with our recent observations (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar), these results indicate that Axin directly binds to APC, β-catenin, and GSK-3β and that it regulates the stabilization of β-catenin. APC cDNA, 293 cells, L cells, and SW480 and DLD-1 cells were kindly supplied from Drs. T. Akiyama (Osaka University, Suita, Japan), K. Morishita (Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo, Japan), A. Nagafuchi and Sh. Tsukita (Kyoto University, Kyoto, Japan), and E. Tahara (Hiroshima University, Hiroshima, Japan), respectively. GST and MBP fusion proteins were purified from Escherichia coli according to the manufacturer's instructions. The anti-APC (Ab-1) and β-catenin antibodies were purchased from Oncogene Science Inc. (Cambridge, MA) and Transduction Laboratories (Lexington, KY), respectively. [35S]Methionine and [35S]cysteine were purchased from Amersham Inc. (Buckinghamshire, United Kingdom). Other materials and chemicals were from commercial sources. pEF-BOS-Myc/rAxin (full-length), pBSKS/rAxin (full-length), pBJ-Myc/rAxin-(1–229), pEF-BOS-Myc/rAxin-(1–713), pBJ-Myc/rAxin-(298–713), pEF-BOS/Myc-rAxin-(298–506), pBJ-Myc/rAxin-(713–832), pGEX-2T/β-catenin, and pMAL-c2/rAxin-(298–506) were constructed as described (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). To construct pGEX-2T/RGS, the RGS cDNA fragment encoding rAxin-(89–216) was synthesized by polymerase chain reaction and inserted into pGEX-2T. To construct pMAL-c2 containing APC mutants, pMKITneo/APC was digested with various restriction enzymes, and the APC cDNA fragments were inserted into pMAL-c2. These procedures will be described in detail elsewhere. To construct pMAL-c2/rAxin (full-length), pBSKS/rAxin was digested with SmaI andEcoRV, and the rAxin cDNA fragment was inserted into pMALc-2, which was digested with XbaI and blunted with Klenow fragment. To construct pGEX-2T/rAxin-(1–529), pBSKS/rAxin was digested with SmaI and PvuII, and this fragment was inserted into SmaI cut pGEX-2T. To construct pCGN/β-catenin, pBSSK/β-catenin was digested with XhoI, blunted with Klenow fragment, and digested with XbaI. The β-catenin cDNA fragment was inserted into pCGN. COS cells (10-cm diameter dish) transfected with pBJ- and pEF-BOS-derived plasmids were lysed as described (17Kikuchi A. Williams L.T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 588-594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (63) Google Scholar, 18Hinoi T. Kishida S. Koyama S. Ikeda M. Matsuura Y. Kikuchi A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19710-19716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (36) Google Scholar, 19Murai H. Ikeda M. Kishida S. Ishida O. Okazaki-Kishida M. Matsuura Y. Kikuchi A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 10483-10490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (56) Google Scholar). rAxin and its deletion mutants were tagged with Myc epitope at their N termini. The lysates (160–800 μg of protein) were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody, then the precipitates were probed with the anti-APC and β-catenin antibodies. When the interaction of the RGS domain of rAxin with APC was examined in vitro, 1 μm GST-RGS was incubated with the lysates (200 μg of protein) of COS, 293, L, SW480, and DLD-1 cells for 2 h at 4 °C. GST-RGS were precipitated with glutathione-Sepharose 4B, and the precipitates were probed with the anti-APC antibody. Various deletion mutants of MBP-APC (0.5–10 pmol) immobilized on the amylose resin were incubated with various concentrations of GST-RGS, GST-rAxin-(1–529), and GST-β-catenin in 100 μl of reaction mixture (20 mm Tris/HCl (pH 7.5) and 1 mm dithiothreitol) for 2 h at 4 °C. MBP fusion proteins were precipitated by centrifugation, and the precipitates were probed with the anti-GST antibody. When the effect of rAxin on the interaction of APC with β-catenin was examined, 50 nmGST-β-catenin was incubated with 250 nmMBP-APC-(959–1338) in the presence of various concentrations of MBP-rAxin-(298–506) or MBP-rAxin (full-length) in 100 μl of reaction mixture for 2 h at 4 °C. GST-β-catenin was precipitated by glutathione-Sepharose 4B, and the precipitates were probed with the anti-MBP antibody. Where specified, the relative intensities of the precipitated GST and MBP fusion proteins were quantitated by densitometric tracing of the stained sheets using an NIH image program. COS cells (60–70% confluent on a 35-mm diameter dish) were transfected with pCGN/β-catenin alone or with pCGN/β-catenin and pEF-BOS-Myc/rAxin (full-length). After 60 h, pulse-chase analysis was performed as described (13Munemitsu S. Albert I. Souza B. Rubinfeld B. Polakis P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 3046-3050Crossref PubMed Scopus (955) Google Scholar). Briefly, the cells were pulse-labeled with [35S]methionine and [35S]cysteine (50 μCi/ml) for 30 min at 37 °C. Then the cells were lysed immediately or at the indicated times following incubation with excess unlabeled methionine and cysteine. The lysates were immunoprecipitated with the anti-HA antibody, and the precipitates were probed with the anti-HA antibody and analyzed with a Fuji BAS 2000 image analyzer. We have recently found that rAxin directly binds to β-catenin (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). Because it has been shown that β-catenin directly binds to APC (10Rubinfeld B. Souza B. Albert I. Müller O. Chamberlain S.H. Masiarz F.R. Munemitsu S. Polakis P. Science. 1993; 262: 1731-1734Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar, 11Su L. Vogelstein B. Kinzler K.W. Science. 1993; 262: 1734-1737Crossref PubMed Scopus (1115) Google Scholar, 12Rubinfeld B. Souza B. Albert I. Munemitsu S. Polakis P. J. Biol. Chem. 1995; 270: 5549-5555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (298) Google Scholar), we examined whether rAxin makes a complex with APC through β-catenin. Various deletion mutants of Myc-rAxin expressed in COS cells were immunoprecipitated with the anti-Myc antibody. Consistent with our recent observations (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar), β-catenin was coprecipitated with Myc-rAxin (full-length), Myc-rAxin-(1–713), Myc-rAxin-(298–713), and Myc-rAxin-(298–506) (Fig. 1 A). Among them, APC was detected in the Myc-rAxin (full-length) and Myc-rAxin-(1–713) immune complexes, but not in the Myc-rAxin-(298–713) and Myc-rAxin-(298–506) immune complexes (Fig. 1 A). Unexpectedly, APC but not β-catenin was detected in the Myc-rAxin-(1–229) immune complex. Neither β-catenin nor APC was coprecipitated with Myc-rAxin-(713–832). Because rAxin-(1–229) contains the RGS domain, we examined whether the RGS domain itself (amino acids 89–216) makes a complex with APC. APC in COS, 293, and L cells was coprecipitated with GST-RGS (Fig. 1 B). It is known that APC is truncated at amino acids 1337 and 1427 in SW480 and DLD-1 cells, respectively, and that these truncated forms of APC fail to down-regulate β-catenin (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar,13Munemitsu S. Albert I. Souza B. Rubinfeld B. Polakis P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 3046-3050Crossref PubMed Scopus (955) Google Scholar). These APC mutants in SW480 and DLD-1 cells were not coprecipitated with GST-RGS (Fig. 1 B). Consistent with the previous observations (10Rubinfeld B. Souza B. Albert I. Müller O. Chamberlain S.H. Masiarz F.R. Munemitsu S. Polakis P. Science. 1993; 262: 1731-1734Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar, 11Su L. Vogelstein B. Kinzler K.W. Science. 1993; 262: 1734-1737Crossref PubMed Scopus (1115) Google Scholar), both full-length and truncated APC were coprecipitated with GST-β-catenin (Fig. 1 B). These results suggest that the RGS domain of rAxin makes a complex with the C-terminal half of APC in intact cells. Taken together with our observations (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar), rAxin has distinct binding sites for APC, β-catenin, and GSK-3β. It is notable that the APC mutants in colorectal carcinoma cell lines such as SW480 and DLD-1 cells do not associate with rAxin. To examine whether the RGS domain of rAxin directly interacts with APC, various deletion mutants of APC were purified as MBP fusion proteins (Fig. 2 A). GST-RGS bound to MBP-APC-(1211–2075), which contains seven 20-aa repeats, in a dose-dependent manner (Fig. 2 B). TheK d value was calculated to be 115 nm. However, GST-RGS did not bind to MBP-APC-(959–1338) which contains three 15-aa repeats and the first 20-aa repeat (Fig. 2 B). These results show that the RGS domain of rAxin directly interacts with the region containing the 20-aa repeats of APC. To characterize the interaction of APC with rAxin further, MBP-APC-(1211–1787), which contains the former four 20-aa repeats, and MBP-APC-(1788–2075), which contains the latter three 20-aa repeats, were purified. Both GST-RGS and GST-β-catenin bound to MBP-APC-(1211–1787), but they bound to MBP-APC-(1788–2075) less efficiently (Fig. 2 C). Furthermore, GST-β-catenin bound to both MBP-APC-(1211–1495) and MBP-APC-(1475–1787), whereas GST-RGS bound to MBP-APC-(1475–1787) but not to MBP-APC-(1211–1495) (Fig. 2 C). Therefore, the RGS domain does not interact with the region of APC containing the 15-aa repeats and the first and the second 20-aa repeats, which binds to β-catenin. These results are consistent with the observations that β-catenin but not the RGS domain of rAxin associated with the APC mutants in SW480 and DLD-1 cells. A family of RGS proteins has been identified in eukaryotic species ranging from yeast to mammals (16Dohlman H.G. Thorner J. J. Biol. Chem. 1997; 272: 3871-3874Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (450) Google Scholar). The three-dimensional structure of a stable complex of RGS4 and Gαi1 has been determined (20Tesmer J.J.G. Berman D.M. Gilman A.G. Sprang S.R. Cell. 1997; 89: 251-261Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (687) Google Scholar). Residues that form the hydrophobic core of the RGS box of RGS4 are well conserved in the RGS domain of rAxin. However, 11 residues of RGS4 that make direct contact with Gαi1 are not conserved in the RGS domain of rAxin except for one amino acid. Therefore, it is conceivable that the RGS domain interacts with the proteins other than the α subunit of G proteins. Our results are the first demonstration that a member of the RGS protein family has a binding partner other than the α subunit of G proteins. We have found that rAxin-(298–506) directly binds to β-catenin-(175–423), which contains armadillo repeats 2–7 (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar). APC interacts with the armadillo repeats 2–10 of β-catenin (12Rubinfeld B. Souza B. Albert I. Munemitsu S. Polakis P. J. Biol. Chem. 1995; 270: 5549-5555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (298) Google Scholar). Therefore, we next examined whether rAxin and APC share the binding site on β-catenin. GST-β-catenin bound to MBP-rAxin-(298–506) and MBP-APC-(959–1338) in a dose-dependent manner, and theirK d values were calculated to be 227 nmand 273 nm, respectively (data not shown). MBP-rAxin-(298–506) inhibited the binding of MBP-APC-(959–1338) to GST-β-catenin in a dose-dependent manner (Fig. 3 A). MBP-rAxin (full-length) also inhibited their binding although the inhibitory efficiency was less than MBP-rAxin-(298–506) (Fig. 3 A). Furthermore, we examined the effect of rAxin-(1–529), which contains the binding sites for APC and β-catenin, on the interaction of β-catenin with MBP-APC-(1211–1787), which binds to both β-catenin and rAxin. Although GST-rAxin-(1–529) bound to MBP-APC-(1211–1787) in a dose-dependent manner, it did not affect significantly the interaction of GST-β-catenin with MBP-APC-(1211–1787) (Fig. 3 B). These results are consistent with the results that in APC-(1211–1787) β-catenin prefers APC-(1211–1495) to APC-(1475–1787); inversely the RGS domain binds to APC-(1475–1787) but not to APC-(1211–1495). Taken together, although the β-catenin-binding sites of rAxin and APC do not simultaneously bind to β-catenin, β-catenin does not compete with rAxin for the binding to APC when they are full-length proteins. Furthermore, since rAxin has distinct binding sites for APC and β-catenin, these three proteins could make a complex. It has been shown that APC down-regulates the level of β-catenin (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar,13Munemitsu S. Albert I. Souza B. Rubinfeld B. Polakis P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 3046-3050Crossref PubMed Scopus (955) Google Scholar). This APC activity was localized to the central region of the protein which contains at least three of the 20-aa repeat sequence (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar). The fragment containing the 15-aa repeats and the first 20-aa repeat does not down-regulate β-catenin (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar). Our results indicate that this region binds to β-catenin but not to the RGS domain of rAxin. Therefore, the binding of APC to β-catenin is not sufficient for decreasing the β-catenin level, and the binding to Axin may be necessary. To investigate whether rAxin regulates the stabilization of β-catenin, pulse-chase analysis in COS cells expressing HA-β-catenin was performed. Although equivalent amounts of HA-β-catenin were immunoprecipitated with the anti-HA antibody from the lysates of COS cells expressing HA-β-catenin alone and coexpressing HA-β-catenin and Myc-rAxin as assessed by immunoblot analysis (data not shown), pulse-labeled. HA-β-catenin gradually decreased with a half-life of 4 h (Fig. 4). When Myc-rAxin was cotransfected, HA-β-catenin exhibited a shorter half-life (Fig. 4). These results indicate that rAxin has an activity to stimulate the down-regulation of β-catenin. To down-regulate β-catenin, its phosphorylation by GSK-3β is required, and the mutations of the phosphorylation site stabilize β-catenin (7Yost C. Torres M. Miller J.R. Huang E. Kimelman D. Moon R.T. Genes Dev. 1996; 10: 1443-1454Crossref PubMed Scopus (1018) Google Scholar). It has been reported recently that β-catenin is ubiquitinated and that the ubiquitination of β-catenin is abolished when the GSK-3β phosphorylation site in β-catenin is mutated (21Aberle H. Bauer A. Stappert J. Kispert A. Kemler R. EMBO J. 1997; 16: 3797-3804Crossref PubMed Scopus (2160) Google Scholar). Therefore, the degradation of β-catenin could be regulated by the ubiquitination-proteasome pathway. Taken together with our observations that rAxin promotes GSK-3β-dependent phosphorylation of β-catenin (5Ikeda S. Kishida S. Yamamoto H. Murai H. Koyama S. Kikuchi A. EMBO J. 1998; 17: 1371-1384Crossref PubMed Scopus (1101) Google Scholar), the present results strongly suggest that rAxin stimulates the down-regulation of β-catenin in cooperation with APC. Literally hundreds of APC mutants have been reported in FAP and cancer patients (9Polakis P. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1332: F127-F147PubMed Google Scholar). Almost all of these mutations are confined to the 5′-half of the APC coding sequence and result in truncation of APC, which lacks the C-terminal half containing most of the 20-aa repeats. Our results indicate that these APC mutants do not interact with rAxin. Therefore, the reason why mutations of APC cause cancer may be due to its inability to bind to Axin. It has been reported that there are mutations of serine in consensus sequence of the phosphorylation site of β-catenin for GSK-3β in melanoma and colon cancer that have normal APC protein (22Korinek V. Barker N. Morin P.J. van Wichen D. de Weger R. Kinzler K.W. Vogelstein B. Clevers H. Science. 1997; 275: 1784-1787Crossref PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 23Morin P.J. Sparks A.B. Korinek V. Barker N. Clevers H. Vogelstein B. Kinzler K.W. Science. 1997; 275: 1787-1790Crossref PubMed Scopus (3504) Google Scholar, 24Rubinfeld B. Robbins P. El-Gamil M. Albert I. Porfiri E. Polakis P. Science. 1997; 275: 1790-1792Crossref PubMed Scopus (1135) Google Scholar). Thus, there are at least two ways to increase levels of β-catenin due to mutations in APC and β-catenin itself. Therefore, mutations in APC-, GSK-3β-, and β-catenin-binding sites on Axin may cause human cancer. We thank Drs. T. Akiyama, K. Morishita, A. Nagafuchi, Sh. Tsukita, and E. Tahara for their plasmids and cell lines. We wish to thank the Research Center for Molecular Medicine, Hiroshima University School of Medicine, for the use of their facilities.

Endocytic proteins such as epsin, AP180, and Hip1R (Sla2p) share a conserved modular region termed the epsin NH 2 -terminal homology (ENTH) domain, which plays a crucial role in clathrin-mediated endocytosis through an unknown target. Here, we demonstrate a strong affinity of the ENTH domain for phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P 2 ]. With nuclear magnetic resonance analysis of the epsin ENTH domain, we determined that a cleft formed with positively charged residues contributed to phosphoinositide binding. Overexpression of a mutant, epsin Lys 76 → Ala 76 , with an ENTH domain defective in phosphoinositide binding, blocked epidermal growth factor internalization in COS-7 cells. Thus, interaction between the ENTH domain and PtdIns(4,5)P 2 is essential for endocytosis mediated by clathrin-coated pits.

In the rabbit mesenteric arterial smooth muscle skinned by saponin, Caa+ induced contraction in a concentration-dependent manner.Guanosine 5'-(3-0thio)triphosphate (GTPyS), a non-hydrolyzable GTP analogue, lowered the Ca2+ concentrations required for this contraction and increased the Ca" sensitivity of the skinned smooth muscle contraction.GTPyS alone did not induce the contraction in the absenoe of Ca".This GTPyS-enhanced Ca2+ sensitivity was completely abolished by an exoenzyme of Staphylococcus aureu8, named EDIN, and an exoenzyme of Clostridium botulinum, named C3, both of which are known to ADPribosylate the rho p21 family that belongs to the rm p21-like small GTP-binding protein superfamily.The GTPyS-bound form of rhoA p21 overcame the inhibitory action of EDIN.smg p21B, another small GTPbinding protein, was inactive.EDIN ADP-ribosylated a protein, which was most likely to be rho p21, in the skinned smooth muscle.The GTPyS-bound form of rhoA p21, but not the GDP-bound form, substituted for GTPyS and enhanced the Ca" sensitivity of the skinned smooth muscle contraction.smg p21B was inactive.These results indicate that rhoA p21 is involved in the GTPyS-enhanced Caa+ sensitivity of the smooth muscle contraction.Cytosolic Ca2+ plays a central role in the contraction of vascular smooth muscle induced by vasoconstrictors such as angiotensin 11, vasopressin, and norepinephine (for a review, see Ref. 1).Ca2+ induces the smooth muscle contraction by activating calmodulin-dependent myosin light chain kinase which then activates myosin ATPase (1).However, the cyto-

Although Wingless (Wg)/Wnt signaling has been implicated in heart development of multiple organisms, conflicting results have been reported regarding the role of Wnt/β-catenin pathway in cardiac myogenesis: Wg/armadillo signaling promotes heart development in Drosophila , whereas activation of Wnt/β-catenin signaling inhibits heart formation in avians and amphibians. Using an in vitro system of mouse ES cell differentiation into cardiomyocytes, we show here that Wnt/β-catenin signaling exhibits developmental stage-specific, biphasic, and antagonistic effects on cardiomyogenesis and hematopoiesis/vasculogenesis. Activation of the Wnt/β-catenin pathway in the early phase during embryoid body (EB) formation enhances ES cell differentiation into cardiomyocytes while suppressing the differentiation into hematopoietic and vascular cell lineages. In contrast, activation of Wnt/β-catenin signaling in the late phase after EB formation inhibits cardiomyocyte differentiation and enhances the expression of hematopoietic/vascular marker genes through suppression of bone morphogenetic protein signaling. Thus, Wnt/β-catenin signaling exhibits biphasic and antagonistic effects on cardiomyogenesis and hematopoiesis/vasculogenesis, depending on the stage of development.

Abstract Wnt-5a is a representative ligand that activates a β-catenin-independent pathway in the Wnt signaling. Although abnormal activation of β-catenin-dependent pathway is often observed in human cancer, the relationship between β-catenin-independent pathway and tumorigenesis is not clear. We sought to clarify how Wnt-5a is involved in aggressiveness of gastric cancer. Abnormal expression of Wnt-5a was observed in 71 of 237 gastric cancer cases by means of immunohistochemistry. The positivity of Wnt-5a expression was correlated with advanced stages and poor prognosis of gastric cancer. Wnt-5a had the abilities to stimulate cell migration and invasion in gastric cancer cells. Wnt-5a activated focal adhesion kinase and small GTP-binding protein Rac, both of which are known to play a role in cell migration. Cell migration, membrane ruffling, and turnover of paxillin were suppressed in Wnt-5a knockdown cells. Furthermore, anti-Wnt-5a antibody suppressed gastric cancer cell migration. These results suggest that Wnt-5a stimulates cell migration by regulating focal adhesion complexes and that Wnt-5a is not only a prognostic factor but also a good therapeutic target for gastric cancer. (Cancer Res 2006; 66(21): 10439-48)