The hexanucleotide repeat expansion (HRE) GGGGCC (G4C2) in C9orf72 is the most common cause of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). Recent studies support an HRE RNA gain-of-function mechanism of neurotoxicity, and we previously identified protein interactors for the G4C2 RNA including RanGAP1. A candidate-based genetic screen in Drosophila expressing 30 G4C2 repeats identified RanGAP (Drosophila orthologue of human RanGAP1), a key regulator of nucleocytoplasmic transport, as a potent suppressor of neurodegeneration. Enhancing nuclear import or suppressing nuclear export of proteins also suppresses neurodegeneration. RanGAP physically interacts with HRE RNA and is mislocalized in HRE-expressing flies, neurons from C9orf72 ALS patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSC-derived neurons), and in C9orf72 ALS patient brain tissue. Nuclear import is impaired as a result of HRE expression in the fly model and in C9orf72 iPSC-derived neurons, and these deficits are rescued by small molecules and antisense oligonucleotides targeting the HRE G-quadruplexes. Nucleocytoplasmic transport defects may be a fundamental pathway for ALS and FTD that is amenable to pharmacotherapeutic intervention. A candidate-based genetic screen in Drosophila expressing 30 G4C2-repeat-containing RNAs finds that RanGAP, a key regulator of nucleocytoplasmic transport, is a potent suppressor of neurodegeneration; the defects caused by the G4C2 repeat expansions can be rescued with antisense oligonucleotides or small molecules targeting the G-quadruplexes. The most common cause of the debilitating disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a hexanucleotide repeat expansion GGGGCC (G4C2) in the C9orf72 gene. Two studies in this issue use contrasting methods to arrive at a molecular mechanism that may cause a familial form of the disease. Using a candidate-based genetic screen in Drosophila expressing 30 G4C2 repeats (Ke Zhang et al.) or an unbiased genetic screen in Drosophila expressing 8, 28 or 58 G4C2 repeat-containing transcripts (Brian Freibaum et al.), the two groups sought genes that enhance or suppress the disease phenotype. Zhang et al. identify the gene encoding RanGAP, a key regulator of nucleocytoplasmic transport, and Freibaum et al. identifies genes that encode components of the nuclear pore and the nucleocytoplasmic transport machinery. Both papers show deficits in nucleocytoplasmic transport in Drosophila cells expressing G4C2 repeats and in iPSC-derived neurons from ALS patients. Zhang et al. show that these defects can be rescued with antisense oligonucleotides or small molecules targeting the G-quadruplexes.

Defects in nucleocytoplasmic transport have been identified as a key pathogenic event in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) mediated by a GGGGCC hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72, the most common genetic cause of ALS/FTD. Furthermore, nucleocytoplasmic transport disruption has also been implicated in other neurodegenerative diseases with protein aggregation, suggesting a shared mechanism by which protein stress disrupts nucleocytoplasmic transport. Here, we show that cellular stress disrupts nucleocytoplasmic transport by localizing critical nucleocytoplasmic transport factors into stress granules, RNA/protein complexes that play a crucial role in ALS pathogenesis. Importantly, inhibiting stress granule assembly, such as by knocking down Ataxin-2, suppresses nucleocytoplasmic transport defects as well as neurodegeneration in C9ORF72-mediated ALS/FTD. Our findings identify a link between stress granule assembly and nucleocytoplasmic transport, two fundamental cellular processes implicated in the pathogenesis of C9ORF72-mediated ALS/FTD and other neurodegenerative diseases.

Huntington’s disease (HD) is caused by an expanded CAG repeat in the Huntingtin (HTT) gene. The mechanism(s) by which mutant HTT (mHTT) causes disease is unclear. Nucleocytoplasmic transport, the trafficking of macromolecules between the nucleus and cytoplasm, is tightly regulated by nuclear pore complexes (NPCs) made up of nucleoporins (NUPs). Previous studies offered clues that mHTT may disrupt nucleocytoplasmic transport and a mutation of an NUP can cause HD-like pathology. Therefore, we evaluated the NPC and nucleocytoplasmic transport in multiple models of HD, including mouse and fly models, neurons transfected with mHTT, HD iPSC-derived neurons, and human HD brain regions. These studies revealed severe mislocalization and aggregation of NUPs and defective nucleocytoplasmic transport. HD repeat-associated non-ATG (RAN) translation proteins also disrupted nucleocytoplasmic transport. Additionally, overexpression of NUPs and treatment with drugs that prevent aberrant NUP biology also mitigated this transport defect and neurotoxicity, providing future novel therapy targets.

Summary The Drosophila melanogaster intestine is an excellent system for elucidating mechanisms regulating stem cell behavior under homeostatic conditions or in response to injury, stress, or ageing. Here we show that the septate junction (SJ) protein Neuroglian (Nrg) is expressed in intestinal stem cells (ISCs) and daughter enteroblasts (EBs) within the fly midgut, the equivalent of the mammalian small intestine. Although Nrg localizes to the plasma membrane, SJs are not present between ISC/EBs, suggesting Nrg plays a different role in this tissue. Generation of ISCs homozygous for a null allele of Nrg revealed that Nrg is required for ISC proliferation in young flies, and depletion of Nrg from ISCs/EBs was able to suppress the increase in ISC proliferation with age. Conversely, overexpression of Nrg in ISC/EBs was sufficient to drive ISC proliferation, leading to an increase in cells expressing ISC/EB markers. In addition, we observed an increase in EGFR activation. Genetic epistasis experiments revealed that Nrg acts upstream of EGFR in the midgut to regulate ISC proliferation. As Nrg function is highly conserved in mammalian systems, our work characterizing the role of Nrg in the intestine has implications for the etiology and treatment of intestinal disorders due to altered ISC behavior.

Abstract Disrupted nucleocytoplasmic transport (NCT) has been implicated in neurodegenerative disease pathogenesis; however, the mechanisms by which impaired NCT causes neurodegeneration remain unclear. In a Drosophila screen, we identified Ref(2)p/p62, a key regulator of autophagy, as a potent suppressor of neurodegeneration caused by the GGGGCC hexanucleotide repeat expansion (G4C2 HRE) in C9orf72 that causes amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). We found that p62 is increased and forms ubiquitinated aggregates due to decreased autophagic cargo degradation. Immunofluorescence and electron microscopy of Drosophila tissues demonstrate an accumulation of lysosome-like organelles that precedes neurodegeneration. These phenotypes are partially caused by cytoplasmic mislocalization of Mitf/TFEB, a key transcriptional regulator of autophagolysosomal function. Additionally, TFEB is mislocalized and downregulated in human cells expressing GGGGCC repeats and in C9-ALS patient motor cortex. Our data suggest that the C9orf72-HRE impairs Mitf/TFEB nuclear import, thereby disrupting autophagy and exacerbating proteostasis defects in C9-ALS/FTD.