Abstract Endothelial cells (EC) are heterogeneous across and within tissues, reflecting distinct, specialised functions. EC heterogeneity has been proposed to underpin EC plasticity independently from vessel microenvironments. However, heterogeneity driven by contact-dependent or short-range cell-cell crosstalk cannot be evaluated with single cell transcriptomic approaches as spatial and contextual information is lost. Nonetheless, quantification of EC heterogeneity and understanding of its molecular drivers is key to developing novel therapeutics for cancer, cardiovascular diseases and for revascularisation in regenerative medicine. Here, we developed an EC profiling tool (ECPT) to examine individual cells within intact monolayers. We used ECPT to characterise different phenotypes in arterial, venous and microvascular EC populations. In line with other studies, we measured heterogeneity in terms of cell cycle, proliferation, and junction organisation. ECPT uncovered a previously under-appreciated single-cell heterogeneity in NOTCH activation. We correlated cell proliferation with different NOTCH activation states at the single cell and population levels. The positional and relational information extracted with our novel approach is key to elucidating the molecular mechanisms underpinning EC heterogeneity. Summary statement Endothelial cells heterogeneity is key to complex collective functions and cell behaviour. We developed a novel image based endothelial cell profiling tool and quantified heterogeneity in NOTCH signalling in monolayers.

Abstract Vascular Endothelial Cells (EC) plasticity is key to homeostasis and its disruption is a hallmark of diseases such as cancer, atherosclerosis, and diabetes. The EC lineage has evolved to address in parallel sensor and actuator functions. This ability is reflected in remarkable phenotypical heterogeneity of EC across different tissues, within the same tissue, and within the same vascular bed as demonstrated by single cell image analysis and transcriptomics studies. However, how the molecular signalling dynamics in EC could generate and maintain such heterogeneity in different contexts is still largely unexplored. Recently we reported that confluent EC have spatially heterogeneous NOTCH signalling pathway (NSP) levels in vitro as confirmed from analysis of available OMICS databases. Here, we show that spatial heterogeneity of NSP levels is a feature of aortic murine endothelia in vivo and recapitulated by human EC in culture despite absence of signalling from mural cells. We study lateral induction and inhibition, cis-interactions and signalling, and target genes autoregulation in NSP. Using mathematical models and experimental observations we report that NSP dynamics can generate stable, periodic, and asynchronous oscillations of the NSP target HES1. Importantly, we observe that cell contact dependent NSP signal oscillations is the most likely parsimonious mechanistic hypothesis justifying observed spatial heterogeneity in endothelia. We propose that NSP is sufficient to enable individual EC in monolayers to acquire different phenotypes dynamically explaining robustness of quiescent endothelia in performing parallel functions.