Abstract Single molecule localization microscopy (SMLM) is irreplaceable among super-resolution microscopies in revealing biological ultra-structures, given its unmatched high resolution. However, its sub-optimal quantitative capability, which is critical for characterizing true biomolecular organization of ultra-structures in cells, has hindered its widest application in biomedical research. Here, in SMLM imaging of cellular structures such as lipid rafts and microtubules with saturation labelling, we identified ultra-bright localizations, each of which is contributed by simultaneous emission of multiple molecules within a diffraction-limit region and has been regarded before as a regular localization from single molecule. Consistently, ultra-bright localizations are also observed in simulated SMLM imaging of endoplasmic reticulum or microtubules from public resource. Furthermore, after calibrating each ultrabright localization into multiple single-molecule localizations using the photon-number-based models, the density of total localizations shows linear correlation with the true molecule density, presenting SMLM with new reconstruction method as a quantitative analysis approach. Therefore, identification and dissection of ultra-bright localizations in SMLM enable the close and quantitative estimate of the true biomolecular organization.

Abstract Single-molecule localization microscopy (SMLM) boosts its applications when combined with the studies of cells, in which nanometer-sized biomolecules are irresolvable due to diffraction limit unless being subjected to SMLM. Although being well immobilized, given the nanometer sizes of biological molecules, they are still capable of movement stochastically around their immobilized sites. The influence of such motion on image quality and possible improvements have not yet been systematically investigated. Here, we accessed the biomolecule stochastic motion in SMLM by calculating the displacements between different localizations from the same molecule in single-molecule samples of Alexa Fluor-647-conjugated oligonucleotides. We found that, for most molecules, localization displacements at random frame intervals are remarkably larger than those between temporally neighbouring frames despite of drift correction, showing that biomolecule stochastic motion is involved in SMLM. Furthermore, the localization displacements were observed to increase with frame intervals and then saturate, suggesting biomolecule stochastic motion is confined within a finite area. Moreover, we showed that the localization precision is deteriorated by enlarging molecule sizes and improved by sample post-fixation. This study reveals confined stochastic motion of biomolecules increase localization uncertainty in SMLM, and improved localization precision can be achieved via restricting biomolecule stochastic motion.