In addition to mitochondrial DNA, mitochondrial double-stranded RNA (mtdsRNA) is exported from mitochondria. However, specific channels for RNA transport have not been demonstrated. Here, we begin to characterize channel candidates for mtdsRNA export from the mitochondrial matrix to the cytosol. Down-regulation of SUV3 resulted in the accumulation of mtdsRNAs in the matrix, whereas down-regulation of PNPase resulted in the export of mtdsRNAs to the cytosol. Targeting experiments show that PNPase functions in both the intermembrane space and matrix. Strand-specific sequencing of the double-stranded RNA confirms the mitochondrial origin. Inhibiting or down-regulating outer membrane proteins VDAC1/2 and BAK/BAX or inner membrane proteins PHB1/2 strongly attenuated the export of mtdsRNAs to the cytosol. The cytosolic mtdsRNAs subsequently localized to large granules containing the stress protein TIA-1 and activated the type 1 interferon stress response pathway. Abundant mtdsRNAs were detected in a subset of non-small-cell lung cancer cell lines that were glycolytic, indicating relevance in cancer biology. Thus, we propose that mtdsRNA is a new damage-associated molecular pattern that is exported from mitochondria in a regulated manner.

Background The accurate genotyping of CYP2D6 is hindered by the very polymorphic nature of the gene, high homology with its pseudogene CYP2D7 , and the occurrence of structural variations. Long read sequencing offers the promise of overcoming some of these challenges, along with the advantage of straightforward variant phasing. We have established methods for sequencing and analysis of DNA amplicons containing the whole CYP2D6 gene, using the GridION nanopore sequencer.Materials and methods Seven reference and 25 clinical samples covering various haplotypes including gene duplication were barcoded and sequenced over two sequencing runs. Sequenced raw reads were analyzed using a pipeline of bioinformatics tools including two mapping tools and two variant calling tools.Results Using minimap2 and nanopolish (mapping and variant calling tools respectively) resulted in the most accurate variant detection. Haplotypes of 52 alleles could be matched accurately to known alleles or subvariants, while the remaining 12 alleles being assigned as novel star (*) allele of novel subvariants of known alleles in the PharmVar CYP2D6 haplotype database. Allele duplication could be detected by analyzing the allelic balance between the sample haplotypes.Conclusion Nanopore sequencing of CYP2D6 offers a high throughput method for genotyping, accurate haplotyping, and detection of new variants and duplicated alleles.* Abbreviations: EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid TRIS HCL : tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloric acid SDS : Sodium dodecyl sulfate TE buffer : Tris-EDTA buffer NaCl : Sodium chloride

Aim: The MinION nanopore sequencing device opens the opportunity to cost-effective and point-of-care DNA sequencing. We developed a multiplex assay targeting pharmacogenetic variants related to clopidogrel and warfarin, two commonly used drugs that show response variability due to genetic polymorphisms. Materials & Methods: Six reference and 78 clinical DNA samples were amplified by PCR to generate 15 amplicons targeting key variants. These products were then barcoded to enable sample multiplexing. Three variant calling tools were used to compare genotyping accuracy. Results and Conclusions: All but three samples were successfully sequenced and genotyped. Nanopolish software achieved accuracy > 90 % for all except one variant. While minor mis-genotyping issues exist, this work demonstrates that drug-specific or broad pharmacogenetic screening assays are possible on the MinION sequencing device.

The mitochondrion is a multifunctional organelle that modulates multiple systems critical for homeostasis during pathophysiological stress. Variation in mitochondrial DNA (mtDNA) copy number (mtDNAcn), a key mitochondrial change associated with chronic stress, is an emerging biomarker for disease pathology and progression. mtDNAcn can be quantified from whole blood samples using qPCR to determine the ratio of mtDNA to nuclear DNA. However, the collection of blood samples in pediatric populations, particularly in infants and young children, can be technically challenging, yield much smaller volume samples, and can be distressing for the patients and their caregivers. Therefore, we have validated a mtDNAcn assay utilizing DNA from simple buccal swabs (Isohelix SK-2S) and report here it's performance in specimens from infants (age = <12 months). Utilizing qPCR to amplify ∼200 bp regions from two mitochondrial ( ND1, ND6 ) and two nuclear ( BECN1, NEB ) genes, we demonstrated absolute (100%) concordance with results from low-pass whole genome sequencing (lpWGS). We believe that this method overcomes key obstacles to measuring mtDNAcn in pediatric populations and creates the possibility for development of clinical assays to measure mitochondrial change during pathophysiological stress.

Pharmacogenomic testing identifies gene polymorphisms impacting drug metabolism, aiding in optimizing treatment efficacy and minimizing toxicity, thus potentially reducing healthcare utilization. 6-mercaptopurine metabolism is affected by thiopurine methyltransferase (TPMT) and nudix hydrolase 15 (NUDT15) polymorphisms. We sought to estimate the budget impact of preemptive pharmacogenomic testing for these genes in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients from an institutional perspective. This is in response to heightened costs associated with supplemental care for adverse events, like severe myelosuppression, resulting from traditional dosing of 6-mercaptopurine.

Abstract The enzyme cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) metabolises approximately 25% of commonly prescribed drugs, including analgesics, anti-hypertensives, and anti-depressants, among many others. Genetic variation in drug metabolising genes can alter how an individual responds to prescribed drugs, including predisposing to adverse drug reactions. The majority of research on the CYP2D6 gene has been carried out in European and East Asian populations, with Indigenous and minority populations greatly underrepresented. However, genetic variation is often population specific and analysis of diverse ethnic groups can reveal differences in alleles that may be of clinical significance. For this reason, we set out to examine the range and frequency of CYP2D6 variants in a sample of 202 Māori and Pacific people living in Aotearoa (New Zealand). We carried out a long PCR to isolate the CYP2D6 region before performing nanopore sequencing to identify all variants and alleles in these samples. We identified eleven novel variants, three of which were exonic missense variations. Six of these occurred in single samples and one was found in 19 samples (9.4% of the cohort). The remaining four novel variants were identified in two samples each. In addition, five new suballeles of CYP2D6 were identified. One striking finding was that CYP2D6*71, an allele of unknown functional status which has been rarely observed in previous studies, occurs at a relatively high frequency (9.2%) within this cohort. These data will help to ensure that CYP2D6 genetic analysis for pharmacogenetic purposes can be carried out accurately and effectively in this population group.