Up to 2% of the oxygen consumed by the mitochondrial respiratory chain undergoes one electron reduction, typically by the semiquinone form of coenzyme Q, to generate the superoxide radical, and subsequently other reactive oxygen species such as hydrogen peroxide and the hydroxyl radical. Under conditions in which mitochondrial generation of reactive oxygen species is increased (such as in the presence of Ca2+ ions or when the mitochondrial antioxidant defense mechanisms are compromised), these reactive oxygen species may lead to irreversible damage of mitochondrial DNA, membrane lipids and proteins, resulting in mitochondrial dysfunction and ultimately cell death. The nature of this damage and the cellular conditions in which it occurs are discussed in this review article.

Reactive oxygen species are a by-product of mitochondrial oxidative phosphorylation, derived from a small quantity of superoxide radicals generated during electron transport. We conducted a comprehensive and quantitative study of oxygen consumption, inner membrane potentials, and H2O2 release in mitochondria isolated from rat brain, heart, kidney, liver, and skeletal muscle, using various respiratory substrates (α-ketoglutarate, glutamate, succinate, glycerol phosphate, and palmitoyl carnitine). The locations and properties of reactive oxygen species formation were determined using oxidative phosphorylation and the respiratory chain modulators oligomycin, rotenone, myxothiazol, and antimycin A and the uncoupler CCCP. We found that in mitochondria isolated from most tissues incubated under physiologically relevant conditions, reactive oxygen release accounts for 0.1–0.2% of O2 consumed. Our findings support an important participation of flavoenzymes and complex III and a substantial role for reverse electron transport to complex I as reactive oxygen species sources. Our results also indicate that succinate is an important substrate for isolated mitochondrial reactive oxygen production in brain, heart, kidney, and skeletal muscle, whereas fatty acids generate significant quantities of oxidants in kidney and liver. Finally, we found that increasing respiratory rates is an effective way to prevent mitochondrial oxidant release under many, but not all, conditions. Altogether, our data uncover and quantify many tissue-, substrate-, and site-specific characteristics of mitochondrial ROS release.

Abstract Palmitic acid is the most abundant saturated fatty acid in human serum. In cell culture systems, palmitate overload is considered a toxic stimulus, and promotes lipid accumulation, insulin resistance, endoplasmic reticulum stress, oxidative stress, as well as cell death. An increased supply of fatty acids has also been shown to change the predominant form of the mitochondrial network, although the metabolic effects of this change are still unclear. Here, we aimed to uncover the early bioenergetic outcomes of lipotoxicity. We incubated hepatic PLC/PRF/5 cells with palmitate conjugated to BSA and followed real-time oxygen consumption and extracellular acidification for 6 hours. Palmitate increased glycolysis as soon as 1 hour after the stimulus, while oxygen consumption was not disturbed, despite overt mitochondrial fragmentation and cellular reductive imbalance. Palmitate only induced mitochondrial fragmentation if glucose and glutamine were available, while glycolytic enhancement did not require glutamine, showing it is not dependent on morphological changes. NAD(P)H levels were significantly abrogated in palmitate-treated cells. Knockdown of the mitochondrial NAD(P) transhydrogenase or addition of the mitochondrial oxidant-generator menadione in control cells modulated ATP production from glycolysis. Indeed, using selective inhibitors, we found that the production of superoxide/hydrogen peroxide at the I Q site of electron transport chain complex I is associated with the metabolic rewiring promoted by palmitate, while not changing mitochondrial oxygen consumption. In conclusion, we demonstrate that increased glycolytic flux linked to mitochondrially-generated redox imbalance is an early bioenergetic result of palmitate overload and lipotoxicity.

Abstract Calcium (Ca 2+ ) is a key regulator in diverse intracellular signaling pathways, and has long been implicated in metabolic control and mitochondrial function. Mitochondria can actively take up large amounts of Ca 2+ , thereby acting as important intracellular Ca 2+ buffers and affecting cytosolic Ca 2+ transients. Excessive mitochondrial matrix Ca 2+ is known to be deleterious due to opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) and consequent membrane potential dissipation, leading to mitochondrial swelling, rupture, and cell death. Moderate Ca 2+ within the organelle, on the other hand, can directly or indirectly activate mitochondrial matrix enzymes, possibly impacting on ATP production. Here, we aimed to determine in a quantitative manner if extra or intramitochondrial Ca 2+ modulate oxidative phosphorylation in mouse liver mitochondria and intact hepatocyte cell lines. To do so, we monitored the effects of more modest versus supra-physiological increases in cytosolic and mitochondrial Ca 2+ on oxygen consumption rates. Isolated mitochondria present increased respiratory control ratios (a measure of oxidative phosphorylation efficiency) when incubated with low (2.4 ± 0.6 μM) and medium (22.0 ± 2.4 μM) Ca 2+ concentrations in the presence of complex I-linked substrates pyruvate plus malate and α-ketoglutarate, respectively, but not complex II-linked succinate. In intact cells, both low and high cytosolic Ca 2+ led to decreased respiratory rates, while ideal rates were present under physiological conditions. High Ca 2+ decreased mitochondrial respiration in a substrate-dependent manner, mediated by mPTP. Overall, our results uncover a Goldilocks effect of Ca 2+ on liver mitochondria, with specific “just right” concentrations that activate oxidative phosphorylation.

Abstract Mitochondria shape intracellular Ca 2+ signaling through the concerted activity of Ca 2+ uptake via mitochondrial calcium uniporter, and efflux from by Na + /Ca 2+ exchangers (NCLX). Here, we describe a novel relationship between NCLX, intracellular Ca 2+ , and autophagic activity. Conditions that stimulate autophagy in vivo and in vitro, such as caloric restriction and nutrient deprivation, upregulate NCLX expression in hepatic tissue and cells. Conversely, knockdown of NCLX impairs basal and starvation-induced autophagy. Similarly, acute inhibition of NCLX activity by CGP 37157 affects bulk and endoplasmic reticulum autophagy (ER-phagy) without significant impacts on mitophagy. Mechanistically, CGP 37157 inhibited the formation of FIP200 puncta and downstream autophagosome biogenesis. Inhibition of NCLX caused decreased cytosolic Ca 2+ levels, and intracellular Ca 2+ chelation similarly suppressed autophagy. Furthermore, chelation did not exhibit an additive effect on NCLX inhibition of autophagy, demonstrating that mitochondrial Ca 2+ efflux regulates autophagy through the modulation of Ca 2+ signaling. Collectively, our results show that the mitochondrial Ca 2+ extrusion pathway through NCLX is an important regulatory node linking nutrient restriction and autophagy regulation.

Abstract Intracellular Ca 2+ concentrations are strictly controlled by plasma membrane transporters, the endoplasmic reticulum, and mitochondria, in which Ca 2+ uptake is mediated by the mitochondrial calcium uniporter complex (MCUc), while efflux occurs mainly through the mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger (NCLX). RNAseq database repository searches led us to identify the Nclx transcript as highly enriched in astrocytes when compared to neurons. To assess the role of NCLX in mouse primary culture astrocytes, we inhibited its function both pharmacologically or genetically. This resulted in re-shaping of cytosolic Ca 2+ signaling and a metabolic shift that increased glycolytic flux and lactate secretion in a Ca 2+ -dependent manner. Interestingly, in vivo genetic deletion of NCLX in hippocampal astrocytes improved cognitive performance in behavioral tasks, whereas hippocampal neuron-specific deletion of NCLX impaired cognitive performance. These results unveil a role for NCLX as a novel modulator of astrocytic glucose metabolism, impacting on cognition.

ABSTRACT Objective Astrocytes play a significant role in the pathology of Multiple Sclerosis (MS). Nevertheless, for ethical reasons, most of the studies in these cells were performed on the Experimental Autoimmune Encephalomyelitis model. As there are significant differences between human and mouse cells, we aimed here to better characterize astrocytes from patients with MS (PwMS), focusing mainly on mitochondrial function and cell metabolism. Methods We obtained and characterized induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived astrocytes from three PwMS and three unaffected controls and performed functional assays including electron microscopy, flow cytometry, cytokine measurement, gene expression, in situ respiration, and metabolomics. Results We detected several differences in MS astrocytes including: (i) enrichment of genes associated with mitophagy and neurodegeneration, (ii) increased mitochondrial fission and decreased mitochondrial to nuclear DNA ratio, indicating disruption of mitochondrial content, (iii) increased production of superoxide and MS-related proinflammatory chemokines, (iv) increased electron transport capacity and proton leak, in line with the increased oxidative stress, and (v) a distinct metabolic profile, with a deficiency in amino acid catabolism and increased sphingolipid metabolism, which have already been linked to MS. Interpretation To our knowledge, this is the first study thoroughly describing the metabolic profile of iPSC-derived astrocytes from PwMS, and validating this model as a powerful tool to study disease mechanisms and to perform non-invasive drug targeting assays in vitro . Our findings recapitulate several disease features described in patients and provide new mechanistic insights into the metabolic rewiring of astrocytes in MS, which could be targeted in future therapeutic studies.

Abstract Obesity significantly decreases life expectancy and increases the incidence of age-related dysfunctions, including β-cell dysregulation leading to inadequate insulin secretion. Here, we show that diluted plasma from obese human donors acutely impairs β-cell integrity and insulin secretion relative to plasma from lean subjects. Similar results were observed with diluted sera from obese rats fed ad libitum , when compared to sera from lean, calorically-restricted, animals. The damaging effects of obese circulating factors on β-cells occurs in the absence of nutrient overload, and mechanistically involves mitochondrial dysfunction, limiting glucose-supported oxidative phosphorylation and ATP production. We demonstrate that increased levels of adiponectin, as found in lean plasma, are the protective characteristic preserving β-cell function; indeed, sera from adiponectin knockout mice limits β-cell metabolic fluxes relative to controls. Furthermore, oxidative phosphorylation and glucose-sensitive insulin secretion, which are completely abrogated in the absence of this hormone, are restored by the presence of adiponectin alone, surprisingly even in the absence of other serological components, for both the insulin-secreting INS1 cell line and primary islets. The addition of adiponectin to cells treated with plasma from obese donors completely restored β-cell functional integrity, indicating the lack of this hormone was causative of the dysfunction. Overall, our results demonstrate that low circulating adiponectin is a key damaging element for β-cells, and suggest strong therapeutic potential for the modulation of the adiponectin signaling pathway in the prevention of age-related β-cell dysfunction. Abstract Figure Graphical Abstract: Incubation of β-cells with sera or plasma from obese rats and humans hampers mitochondrial oxidative phosphorylation and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) relative to sera and plasma from lean rats and humans. Adiponectin, found at elevated levels in lean subjects, supports β-cell function on its own, in the absence of sera, and also reverses the effects of obese plasma. Prepared using Biorender.com.

Caloric restriction (CR) is widely known to increase life span and resistance against different types of injuries in several organisms. We have previously shown that mitochondria from livers or brains of CR animals exhibit higher calcium uptake rates and lower sensitivity to calcium-induced mitochondrial permeability transition (mPT), an event related to the resilient phenotype exhibited by these organs. Given the importance of calcium in metabolic control and cell homeostasis, we aimed here to uncover possible changes in mitochondrial calcium handling, redox balance and bioenergetics in cardiac and skeletal muscle mitochondria. Unexpectedly, we found that CR does not alter the susceptibility to mPT in muscle (cardiac or skeletal), nor calcium uptake rates. Despite the lack in changes in calcium transport properties, CR consistently decreased respiration in the presence of ATP synthesis in heart and soleus muscle. In heart, such changes were accompanied by a decrease in respiration in the absence of ATP synthesis, lower maximal respiratory rates and a reduced rate of hydrogen peroxide release. Hydrogen peroxide release was unaltered by CR in skeletal muscle. No changes were observed in inner membrane potentials and respiratory control ratios. Together, these results highlight the tissue-specific bioenergetic and ion transport effects induced by CR, demonstrating that resilience against calcium-induced mPT is not present in all tissues.