By monitoring ctDNA, the authors reveal the dynamic adaption of clonal populations in colorectal cancer patients treated with anti-EGFR therapy, suggesting that therapeutic re-challenge may have some benefit. Colorectal cancers (CRCs) evolve by a reiterative process of genetic diversification and clonal evolution. The molecular profile of CRC is routinely assessed in surgical or bioptic samples1. Genotyping of CRC tissue has inherent limitations; a tissue sample represents a single snapshot in time, and it is subjected to spatial selection bias owing to tumor heterogeneity. Repeated tissue samples are difficult to obtain and cannot be used for dynamic monitoring of disease progression and response to therapy. We exploited circulating tumor DNA (ctDNA) to genotype colorectal tumors and track clonal evolution during treatment with the epidermal growth factor receptor (EGFR)-specific antibodies cetuximab or panitumumab. We identified alterations in ctDNA of patients with primary or acquired resistance to EGFR blockade in the following genes: KRAS, NRAS, MET, ERBB2, FLT3, EGFR and MAP2K1. Mutated KRAS clones, which emerge in blood during EGFR blockade, decline upon withdrawal of EGFR-specific antibodies, indicating that clonal evolution continues beyond clinical progression. Pharmacogenomic analysis of CRC cells that had acquired resistance to cetuximab reveals that upon antibody withdrawal KRAS clones decay, whereas the population regains drug sensitivity. ctDNA profiles of individuals who benefit from multiple challenges with anti-EGFR antibodies exhibit pulsatile levels of mutant KRAS. These results indicate that the CRC genome adapts dynamically to intermittent drug schedules and provide a molecular explanation for the efficacy of rechallenge therapies based on EGFR blockade.

Abstract EGF receptor (EGFR)-targeted monoclonal antibodies are effective in a subset of metastatic colorectal cancers. Inevitably, all patients develop resistance, which occurs through emergence of KRAS mutations in approximately 50% of the cases. We show that amplification of the MET proto-oncogene is associated with acquired resistance in tumors that do not develop KRAS mutations during anti-EGFR therapy. Amplification of the MET locus was present in circulating tumor DNA before relapse was clinically evident. Functional studies show that MET activation confers resistance to anti-EGFR therapy both in vitro and in vivo. Notably, in patient-derived colorectal cancer xenografts, MET amplification correlated with resistance to EGFR blockade, which could be overcome by MET kinase inhibitors. These results highlight the role of MET in mediating primary and secondary resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer and encourage the use of MET inhibitors in patients displaying resistance as a result of MET amplification. Significance: Amplification of the MET proto-oncogene is responsible for de novo and acquired resistance to anti-EGFR therapy in a subset of colorectal cancers. As multiple anti-MET therapeutic strategies are available, these findings offer immediate novel opportunities to design clinical studies. Cancer Discov; 3(6); 658–73. ©2013 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 591

Abstract How genomic heterogeneity associated with acquired resistance to targeted agents affects response to subsequent therapy is unknown. We studied EGFR blockade in colorectal cancer to assess whether tissue and liquid biopsies can be integrated with radiologic imaging to monitor the impact of individual oncogenic alterations on lesion-specific responses. Biopsy of a patient's progressing liver metastasis following prolonged response to cetuximab revealed a MEK1K57T mutation as a novel mechanism of acquired resistance. This lesion regressed upon treatment with panitumumab and the MEK inhibitor trametinib. In circulating tumor DNA (ctDNA), mutant MEK1 levels declined with treatment, but a previously unrecognized KRASQ61H mutation was also identified that increased despite therapy. This same KRAS mutation was later found in a separate nonresponding metastasis. In summary, parallel analyses of tumor biopsies and serial ctDNA monitoring show that lesion-specific radiographic responses to subsequent targeted therapies can be driven by distinct resistance mechanisms arising within separate tumor lesions in the same patient. Significance: Molecular heterogeneity ensuing from acquired resistance drives lesion-specific responses to subsequent targeted therapies. Analysis of a single-lesion biopsy is inadequate to guide selection of subsequent targeted therapies. ctDNA profiles allow the detection of concomitant resistance mechanisms residing in separate metastases and assessment of the effect of therapies designed to overcome resistance. Cancer Discov; 6(2); 147–53. ©2015 AACR. See related commentary by Hiley and Swanton, p. 122. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 109

Entrectinib is a first-in-class pan-TRK kinase inhibitor currently undergoing clinical testing in colorectal cancer and other tumor types. A patient with metastatic colorectal cancer harboring an LMNA-NTRK1 rearrangement displayed a remarkable response to treatment with entrectinib, which was followed by the emergence of resistance. To characterize the molecular bases of the patient's relapse, circulating tumor DNA (ctDNA) was collected longitudinally during treatment, and a tissue biopsy, obtained before entrectinib treatment, was transplanted in mice (xenopatient), which then received the same entrectinib regimen until resistance developed. Genetic profiling of ctDNA and xenopatient samples showed acquisition of two point mutations in the catalytic domain of NTRK1, p.G595R and p.G667C. Biochemical and pharmacologic analysis in multiple preclinical models confirmed that either mutation renders the TRKA kinase insensitive to entrectinib. These findings can be immediately exploited to design next-generation TRKA inhibitors.We provide proof of principle that analyses of xenopatients (avatar) and liquid biopsies allow the identification of drug resistance mechanisms in parallel with clinical treatment of an individual patient. We describe for the first time that p.G595R and p.G667C TRKA mutations drive acquired resistance to entrectinib in colorectal cancers carrying NTRK1 rearrangements.

The development of molecularly targeted anticancer agents relies on large panels of tumour-specific preclinical models closely recapitulating the molecular heterogeneity observed in patients. Here we describe the mutational and gene expression analyses of 151 colorectal cancer (CRC) cell lines. We find that the whole spectrum of CRC molecular and transcriptional subtypes, previously defined in patients, is represented in this cell line compendium. Transcriptional outlier analysis identifies RAS/BRAF wild-type cells, resistant to EGFR blockade, functionally and pharmacologically addicted to kinase genes including ALK, FGFR2, NTRK1/2 and RET. The same genes are present as expression outliers in CRC patient samples. Genomic rearrangements (translocations) involving the ALK and NTRK1 genes are associated with the overexpression of the corresponding proteins in CRC specimens. The approach described here can be used to pinpoint CRCs with exquisite dependencies to individual kinases for which clinically approved drugs are already available.

Abstract Purpose: Patients with colorectal cancer who respond to the anti-EGFR antibody cetuximab often develop resistance within several months of initiating therapy. To design new lines of treatment, the molecular landscape of resistant tumors must be ascertained. We investigated the role of mutations in the EGFR signaling axis on the acquisition of resistance to cetuximab in patients and cellular models. Experimental Design: Tissue samples were obtained from 37 patients with colorectal cancer who became refractory to cetuximab. Colorectal cancer cells sensitive to cetuximab were treated until resistant derivatives emerged. Mutational profiling of biopsies and cell lines was performed. Structural modeling and functional analyses were performed to causally associate the alleles to resistance. Results: The genetic profile of tumor specimens obtained after cetuximab treatment revealed the emergence of a complex pattern of mutations in EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, and PIK3CA genes, including two novel EGFR ectodomain mutations (R451C and K467T). Mutational profiling of cetuximab-resistant cells recapitulated the molecular landscape observed in clinical samples and revealed three additional EGFR alleles: S464L, G465R, and I491M. Structurally, these mutations are located in the cetuximab-binding region, except for the R451C mutant. Functionally, EGFR ectodomain mutations prevent binding to cetuximab but a subset is permissive for interaction with panitumumab. Conclusions: Colorectal tumors evade EGFR blockade by constitutive activation of downstream signaling effectors and through mutations affecting receptor–antibody binding. Both mechanisms of resistance may occur concomitantly. Our data have implications for designing additional lines of therapy for patients with colorectal cancer who relapse upon treatment with anti-EGFR antibodies. Clin Cancer Res; 21(9); 2157–66. ©2015 AACR.

Blockade of the epidermal growth factor receptor (EGFR) with the monoclonal antibodies cetuximab or panitumumab is effective in a subset of colorectal cancers (CRCs), but the emergence of resistance limits the efficacy of these therapeutic agents. At relapse, the majority of patients develop RAS mutations, while a subset acquires EGFR extracellular domain (ECD) mutations. Here we find that patients who experience greater and longer responses to EGFR blockade preferentially develop EGFR ECD mutations, while RAS mutations emerge more frequently in patients with smaller tumour shrinkage and shorter progression-free survival. In circulating cell-free tumour DNA of patients treated with anti-EGFR antibodies, RAS mutations emerge earlier than EGFR ECD variants. Subclonal RAS but not EGFR ECD mutations are present in CRC samples obtained before exposure to EGFR blockade. These data indicate that clonal evolution of drug-resistant cells is associated with the clinical outcome of CRC patients treated with anti-EGFR antibodies.

Neoantigens that arise as a consequence of tumour-specific mutations can be recognized by T lymphocytes leading to effective immune surveillance. In colorectal cancer (CRC) and other tumour types, a high number of neoantigens is associated with patient response to immune therapies. The molecular processes governing the generation of neoantigens and their turnover in cancer cells are poorly understood. We exploited CRC as a model system to understand how alterations in DNA repair pathways modulate neoantigen profiles over time. We performed Whole Exome Sequencing (WES) and RNA sequencing (RNAseq) in CRC cell lines, in vitro and vivo, and in CRC patient-derived xenografts (PDXs) to track longitudinally genomic profiles, clonal evolution, mutational signatures and predicted neoantigens. The majority of CRC models showed remarkably stable mutational and neoantigen profiles, however those carrying defects in DNA repair genes continuously diversified. Rapidly evolving and evolutionary stable CRCs displayed characteristic genomic signatures, and transcriptional profiles. Downregulation of molecules implicated in antigen presentation occurred selectively in highly mutated and rapidly-evolving CRC. These results indicate that CRC carrying alterations in DNA repair pathways display dynamic neoantigen patterns that fluctuate over time. We define CRC subsets characterized by slow and fast evolvability and link this phenotype to downregulation of antigen-presenting cellular mechanisms. Longitudinal monitoring of the neoantigen landscape could be relevant in the context of precision medicine.