The skeletons of adult echinoderms comprise large single crystals of calcite with smooth convoluted fenestrated morphologies, raising many questions about how they form. By using water etching, infrared spectroscopy, electron diffraction, and environmental scanning electron microscopy, we show that sea urchin spine regeneration proceeds via the initial deposition of amorphous calcium carbonate. Because most echinoderms produce the same type of skeletal material, they probably all use this same mechanism. Deposition of transient amorphous phases as a strategy for producing single crystals with complex morphology may have interesting implications for the development of sophisticated materials.

Sea urchin larval spicules transform amorphous calcium carbonate (ACC) into calcite single crystals. The mechanism of transformation is enigmatic: the transforming spicule displays both amorphous and crystalline properties, with no defined crystallization front. Here, we use X-ray photoelectron emission spectromicroscopy with probing size of 40-200 nm. We resolve 3 distinct mineral phases: An initial short-lived, presumably hydrated ACC phase, followed by an intermediate transient form of ACC, and finally the biogenic crystalline calcite phase. The amorphous and crystalline phases are juxtaposed, often appearing in adjacent sites at a scale of tens of nanometers. We propose that the amorphous-crystal transformation propagates in a tortuous path through preexisting 40- to 100-nm amorphous units, via a secondary nucleation mechanism.

As one of the most abundant materials in the world, calcium carbonate, CaCO3, is the main constituent of the skeletons and shells of various marine organisms. It is used in the cement industry and plays a crucial role in the global carbon cycle and formation of sedimentary rocks. For more than a century, only three polymorphs of pure CaCO3-calcite, aragonite, and vaterite-were known to exist at ambient conditions, as well as two hydrated crystal phases, monohydrocalcite (CaCO3·1H2O) and ikaite (CaCO3·6H2O). While investigating the role of magnesium ions in crystallization pathways of amorphous calcium carbonate, we unexpectedly discovered an unknown crystalline phase, hemihydrate CaCO3·½H2O, with monoclinic structure. This discovery may have important implications in biomineralization, geology, and industrial processes based on hydration of CaCO3.

Abstract The lateral eyes of the horseshoe crab, Limulus polyphemus , are the largest compound eyes within recent Arthropoda. The cornea of these eyes contains hundreds of inward projecting elongated cuticular cones and concentrate light onto proximal photoreceptor cells. Although this visual system has been extensively studied before, the precise mechanism allowing vision has remained controversial. Correlating high‐resolution quantitative refractive index (RI) mapping and structural analysis, it is demonstrated how gradients of RI in the cornea stem from structural and compositional gradients in the cornea. In particular, these RI variations result from the chitin‐protein fibers architecture, heterogeneity in protein composition, and bromine doping, as well as spatial variation in water content resulting from matrix cross‐linking on the one hand and cuticle porosity on the other hand. Combining the realistic cornea structure and measured RI gradients with full‐wave optical modeling and ray tracing, it is revealed that the light collection mechanism switches from refraction‐based graded index (GRIN) optics at normal light incidence to combined GRIN and total internal reflection mechanism at high incident angles. The optical properties of the cornea are governed by different mechanisms at different hierarchical levels, demonstrating the remarkable versatility of arthropod cuticle.

The geometrical similarity of helicoidal fiber arrangement in many biological fibrous extracellular matrices, such as bone, plant cell wall or arthropod cuticle, to that of cholesteric liquid mesophases has led to the hypothesis that they may form passively through a mesophase precursor rather than by direct cellular control. In search of direct evidence to support or refute this hypothesis, here, we studied the process of cuticle formation in the tibia of the migratory locust, Locusta migratoria, where daily growth layers arise by the deposition of fiber arrangements alternating between unidirectional and helicoidal structures. Using FIB/SEM volume imaging and scanning X-ray scattering, we show that the epidermal cells determine an initial fiber orientation from which the final architecture emerges by the self-organized co-assembly of chitin and proteins. Fiber orientation in the locust cuticle is therefore determined by both active and passive processes.

Abstract The lateral eyes of the horseshoe crab, Limulus polyphemus , are the largest compound eyes within recent Arthropoda. While this visual system has been extensively described before, the precise mechanism allowing vision has remained controversial. Correlating quantitative refractive index (RI) mapping and detailed structural analysis, we demonstrate how gradients of RI in the cornea result from the hierarchical organization of chitin-protein fibers, heterogeneity in protein composition and bromine doping, as well as spatial variation in water content. Combining the realistic cornea structure and measured RI gradients with full-wave optical modelling and ray-tracing approaches, we show that the light collection mechanism depends on both refraction-based graded index (GRIN) optics and total internal reflection. The optical properties of the cornea are governed by different mechanisms at different hierarchical levels, demonstrating the remarkable versatility of arthropod cuticle. One-sentence summary Structural hierarchy and protein hydration determine the optical performance of the cornea of L. polyphemus .

Abstract Biomineralization had apparently evolved independently in different phyla, using distinct minerals, organic scaffolds and gene regulatory networks (GRNs). However, diverse eukaryotes from unicellular organisms, through echinoderms to vertebrates, use the actomyosin network during biomineralization. Specifically, the actomyosin remodeling protein, Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) regulates cell differentiation and gene expression in vertebrates’ biomineralizing cells, yet, little is known on ROCK’s role in invertebrates’ biomineralization. Here we reveal that ROCK controls the formation, growth and morphology of the calcite spicules in the sea urchin larva. ROCK expression is elevated in the sea urchin skeletogenic cells downstream of the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling. ROCK inhibition leads to skeletal loss and disrupts skeletogenic gene expression. ROCK inhibition after spicule formation reduces spicule elongation rate and induces ectopic spicule branching. Similar skeletogenic phenotypes are observed when ROCK is inhibited in a skeletogenic cell culture, indicating that these phenotypes are due to ROCK activity specifically in the skeletogenic cells. Reduced skeletal growth and enhanced branching are also observed under direct perturbations of the actomyosin network. We propose that ROCK and the actomyosin machinery were employed independently, downstream of distinct GRNs, to regulate biomineral growth and morphology in Eukaryotes.

Abstract Biofilms are multicellular microbial communities that encase themselves in an extracellular matrix (ECM) of secreted biopolymers and attach to surfaces and interfaces. Bacterial biofilms are detrimental in hospital and industrial settings, but they can be beneficial in agricultural contexts. An essential property of biofilms that grants them with increased survival relative to planktonic cells is phenotypic heterogeneity; the division of the biofilm population into functionally distinct subgroups of cells. Phenotypic heterogeneity in biofilms can be traced to the cellular level, however, the molecular structures and elemental distribution across whole biofilms as well as possible linkages between them remain unexplored. Mapping X-ray diffraction (XRD) across intact biofilms in time and space, we revealed the dominant structural features in Bacillus subtilis biofilms, stemming from matrix components, spores and water. By simultaneously following the X-ray fluorescence (XRF) signal of biofilms and isolated matrix components, we discovered that the ECM preferentially binds calcium ions over other metal ions, specifically, zinc, manganese and iron. These ions, remaining free to flow below macroscopic wrinkles that act as water channels, eventually accumulate and lead to sporulation. The possible link between ECM properties, regulation of metal ion distribution and sporulation across whole intact biofilms unravels the importance of molecular-level heterogeneity in shaping biofilm physiology and development. Significance Statement Biofilms are multicellular soft microbial communities that are able to colonize synthetic surfaces as well as living organisms. To survive sudden environmental changes and efficiently share their common resources, cells in a biofilm divide into subgroups with distinct functions, leading to phenotypic heterogeneity. Here, by studying intact biofilms by synchrotron X-ray diffraction and fluorescence, we revealed correlations between biofilm macroscopic architectural heterogeneity and the spatio-temporal distribution of extracellular matrix, spores, water and metal ions. Our findings demonstrate that biofilm heterogeneity is not only affected by local genetic expression and cellular differentiation, but also by passive effects resulting from the physicochemical properties of the molecules secreted by the cells, leading to differential distribution of nutrients that propagates through macroscopic length scales.