Mutations of the mitochondrial genome (mtDNA) underlie a substantial portion of mitochondrial disease burden. These disorders are currently incurable and effectively untreatable, with heterogeneous penetrance, presentation and prognosis. To address the lack of effective treatment for these disorders, we exploited a recently developed mouse model that recapitulates common molecular features of heteroplasmic mtDNA disease in cardiac tissue: the m.5024C>T tRNAAla mouse. Through application of a programmable nuclease therapy approach, using systemically administered, mitochondrially targeted zinc-finger nucleases (mtZFN) delivered by adeno-associated virus, we induced specific elimination of mutant mtDNA across the heart, coupled to a reversion of molecular and biochemical phenotypes. These findings constitute proof of principle that mtDNA heteroplasmy correction using programmable nucleases could provide a therapeutic route for heteroplasmic mitochondrial diseases of diverse genetic origin.

SUMMARY The epitranscriptome plays a key regulatory role in cellular processes in health and disease, including ribosome biogenesis. Here, analysis of the human mitochondrial transcriptome shows that 2’- O -methylation is limited to residues of the mitoribosomal large subunit (mtLSU) 16S mt-rRNA, modified by MRM1, MRM2, and MRM3. Ablation of MRM2 leads to a severe impairment of the oxidative phosphorylation system, caused by defective mitochondrial translation and accumulation of mtLSU assembly intermediates. Structures of these particles (2.58 Å) present disordered RNA domains, partial occupancy of bL36m and bound MALSU1:L0R8F8:mtACP anti-association module. Additionally, we present five mtLSU assembly states with different intersubunit interface configurations. Complementation studies demonstrate that the methyltransferase activity of MRM2 is dispensable for mitoribosome biogenesis. The Drosophila melanogaster orthologue, DmMRM2 , is an essential gene, with its knock-down leading to developmental arrest. This work identifies a key late-stage quality control step during mtLSU assembly, ultimately contributing to the maintenance of mitochondrial homeostasis.

Maintenance and expression of mitochondrial DNA is indispensable for proper function of the oxidative phosphorylation machinery. Post-transcriptional modification of mitochondrial RNA has emerged as one of the key regulatory steps of human mitochondrial gene expression. Mammalian NOP2/Sun RNA Methyltransferase Family Member 2 (NSUN2) has been characterised as an RNA methyltransferase that introduces 5-methylcytosine (m5C) in nuclear-encoded tRNAs, mRNAs, microRNA and noncoding RNAs. In these roles, NSUN2 has been associated with cell proliferation and differentiation. Pathogenic variants in NSUN2 have been linked with neurodevelopmental disorders. Here we employ spatially restricted proximity labelling and immunodetection to demonstrate that NSUN2 is imported into the matrix of mammalian mitochondria. Using three genetic models for NSUN2 inactivation – knockout mice, patient-derived fibroblasts and CRISPR/Cas9 knockout in human cells – we show that NSUN2 in necessary for the generation of m5C at positions 48, 49 and 50 of several mammalian mitochondrial tRNAs. Finally, we show that inactivation of NSUN2 does not have a profound effect on mitochondrial tRNA stability and oxidative phosphorylation in differentiated cells. We discuss the importance of the newly discovered function of NSUN2 in the context of human disease.

Mitochondria contain their own translation apparatus which enables them to produce the polypeptides encoded in their genome. The mitochondrially-encoded RNA components of the mitochondrial ribosome require various post-transcriptional processing steps. Additional protein factors are required to facilitate the biogenesis of the functional mitoribosome. We have characterised a mitochondrially-localized protein, YbeY, which interacts with the assembling mitoribosome through the small subunit. Loss of YbeY leads to a severe reduction in mitochondrial translation and a loss of cell viability, caused by less accurate mitochondrial mt-tRNASer(AGY) processing from the primary transcript and an accumulation of immature mitochondrial small subunit. Our results suggest that YbeY performs a dual function in mitochondria coupling tRNA processing to mitoribosome biogenesis.