Tubulointerstitial disease, a prominent phenomenon in diabetic nephropathy, correlates with decline in renal function. The underlying pathogenic link between chronic hyperglycemia and the development of tubulointerstitial injury has not been fully elucidated, but myofibroblast formation represents a key step in the development of tubulointerstitial fibrosis. RAGE, the receptor for advanced glycation end products (AGEs), induces the expression of TGF-beta and other cytokines that are proposed to mediate the transdifferentiation of epithelial cells to form myofibroblasts. Here we report specific binding of (125)I-AGE-BSA to cell membranes prepared from a rat proximal tubule cell line and show that the binding site was RAGE. AGE exposure induced dose-dependent epithelial-myofibroblast transdifferentiation determined by morphological changes, de novo alpha smooth-muscle actin expression, and loss of epithelial E-cadherin staining. These effects could be blocked with neutralizing Ab's to RAGE or to TGF-beta. Transdifferentiation was also apparent in the proximal tubules of diabetic rats and in a renal biopsy from a patient with type 1 diabetes. The AGE cross-link breaker, phenyl-4,5-dimethylthiazolium bromide (ALT 711) reduced transdifferentiation in diabetic rats in association with reduced tubular AGE and TGF-beta expression. This study provides a novel mechanism to explain the development of tubulointerstitial disease in diabetic nephropathy and provides a new treatment target.

OBJECTIVE Type 2 diabetes (T2DM) is associated with brain atrophy and cerebrovascular disease. We aimed to define the regional distribution of brain atrophy in T2DM and to examine whether atrophy or cerebrovascular lesions are feasible links between T2DM and cognitive function. RESEARCH DESIGN AND METHODS This cross-sectional study used magnetic resonance imaging (MRI) scans and cognitive tests in 350 participants with T2DM and 363 participants without T2DM. With voxel-based morphometry, we studied the regional distribution of atrophy in T2DM. We measured cerebrovascular lesions (infarcts, microbleeds, and white matter hyperintensity [WMH] volume) and atrophy (gray matter, white matter, and hippocampal volumes) while blinded to T2DM status. With use of multivariable regression, we examined for mediation or effect modification of the association between T2DM and cognitive measures by MRI measures. RESULTS T2DM was associated with more cerebral infarcts and lower total gray, white, and hippocampal volumes (all P < 0.05) but not with microbleeds or WMH. T2DM-related gray matter loss was distributed mainly in medial temporal, anterior cingulate, and medial frontal lobes, and white matter loss was distributed in frontal and temporal regions. T2DM was associated with poorer visuospatial construction, planning, visual memory, and speed (P ≤ 0.05) independent of age, sex, education, and vascular risk factors. The strength of these associations was attenuated by almost one-half when adjusted for hippocampal and total gray volumes but was unchanged by adjustment for cerebrovascular lesions or white matter volume. CONCLUSIONS Cortical atrophy in T2DM resembles patterns seen in preclinical Alzheimer disease. Neurodegeneration rather than cerebrovascular lesions may play a key role in T2DM-related cognitive impairment.

The formation of advanced glycation end products (AGEs) on extracellular matrix components leads to accelerated increases in collagen cross linking that contributes to myocardial stiffness in diabetes. This study determined the effect of the crosslink breaker, ALT-711 on diabetes-induced cardiac disease. Streptozotocin diabetes was induced in Sprague-Dawley rats for 32 weeks. Treatment with ALT-711 (10 mg/kg) was initiated at week 16. Diabetic hearts were characterized by increased left ventricular (LV) mass and brain natriuretic peptide (BNP) expression, decreased LV collagen solubility, and increased collagen III gene and protein expression. Diabetic hearts had significant increases in AGEs and increased expression of the AGE receptors, RAGE and AGE-R3, in association with increases in gene and protein expression of connective tissue growth factor (CTGF). ALT-711 treatment restored LV collagen solubility and cardiac BNP in association with reduced cardiac AGE levels and abrogated the increase in RAGE, AGE-R3, CTGF, and collagen III expression. The present study suggests that AGEs play a central role in many of the alterations observed in the diabetic heart and that cleavage of preformed AGE crosslinks with ALT-711 leads to attenuation of diabetes-associated cardiac abnormalities in rats. This provides a potential new therapeutic approach for cardiovascular disease in human diabetes.

Damaged mitochondria generate an excess of superoxide, which may mediate tissue injury in diabetes. We hypothesized that in diabetic nephropathy, advanced glycation end-products (AGEs) lead to increases in cytosolic reactive oxygen species (ROS), which facilitate the production of mitochondrial superoxide. In normoglycemic conditions, exposure of primary renal cells to AGEs, transient overexpression of the receptor for AGEs (RAGE) with an adenoviral vector, and infusion of AGEs to healthy rodents each induced renal cytosolic oxidative stress, which led to mitochondrial permeability transition and deficiency of mitochondrial complex I. Because of a lack of glucose-derived NADH, which is the substrate for complex I, these changes did not lead to excess production of mitochondrial superoxide; however, when we performed these experiments in hyperglycemic conditions in vitro or in diabetic rats, we observed significant generation of mitochondrial superoxide at the level of complex I, fueled by a sustained supply of NADH. Pharmacologic inhibition of AGE-RAGE–induced mitochondrial permeability transition in vitro abrogated production of mitochondrial superoxide; we observed a similar effect in vivo after inhibiting cytosolic ROS production with apocynin or lowering AGEs with alagebrium. Furthermore, RAGE deficiency prevented diabetes-induced increases in renal mitochondrial superoxide and renal cortical apoptosis in mice. Taken together, these studies suggest that AGE-RAGE–induced cytosolic ROS production facilitates mitochondrial superoxide production in hyperglycemic environments, providing further evidence of a role for the advanced glycation pathway in the development and progression of diabetic nephropathy.

Background— Low plasma high-density lipoprotein (HDL) is associated with elevated cardiovascular risk and aspects of the metabolic syndrome. We hypothesized that HDL modulates glucose metabolism via elevation of plasma insulin and through activation of the key metabolic regulatory enzyme, AMP-activated protein kinase, in skeletal muscle. Methods and Results— Thirteen patients with type 2 diabetes mellitus received both intravenous reconstituted HDL (rHDL: 80 mg/kg over 4 hours) and placebo on separate days in a double-blind, placebo-controlled crossover study. A greater fall in plasma glucose from baseline occurred during rHDL than during placebo (at 4 hours rHDL=−2.6±0.4; placebo=−2.1±0.3mmol/L; P =0.018). rHDL increased plasma insulin (at 4 hours rHDL=3.4±10.0; placebo= −19.2±7.4 pmol/L; P =0.034) and also the homeostasis model assessment β-cell function index (at 4 hours rHDL=18.9±5.9; placebo=8.6±4.4%; P =0.025). Acetyl-CoA carboxylase β phosphorylation in skeletal muscle biopsies was increased by 1.7±0.3-fold after rHDL, indicating activation of the AMP-activated protein kinase pathway. Both HDL and apolipoprotein AI increased glucose uptake (by 177±12% and 144±18%, respectively; P <0.05 for both) in primary human skeletal muscle cell cultures established from patients with type 2 diabetes mellitus (n=5). The mechanism is demonstrated to include stimulation of the ATP-binding cassette transporter A1 with subsequent activation of the calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase and the AMP-activated protein kinase pathway. Conclusions— rHDL reduced plasma glucose in patients with type 2 diabetes mellitus by increasing plasma insulin and activating AMP-activated protein kinase in skeletal muscle. These findings suggest a role for HDL-raising therapies beyond atherosclerosis to address type 2 diabetes mellitus.

Activation of the receptor for advanced glycation end products (RAGE) in diabetic vasculature is considered to be a key mediator of atherogenesis. This study examines the effects of deletion of RAGE on the development of atherosclerosis in the diabetic apoE(-/-) model of accelerated atherosclerosis.ApoE(-/-) and RAGE(-/-)/apoE(-/-) double knockout mice were rendered diabetic with streptozotocin and followed for 20 weeks, at which time plaque accumulation was assessed by en face analysis.Although diabetic apoE(-/-) mice showed increased plaque accumulation (14.9 +/- 1.7%), diabetic RAGE(-/-)/apoE(-/-) mice had significantly reduced atherosclerotic plaque area (4.9 +/- 0.4%) to levels not significantly different from control apoE(-/-) mice (4.3 +/- 0.4%). These beneficial effects on the vasculature were associated with attenuation of leukocyte recruitment; decreased expression of proinflammatory mediators, including the nuclear factor-kappaB subunit p65, VCAM-1, and MCP-1; and reduced oxidative stress, as reflected by staining for nitrotyrosine and reduced expression of various NADPH oxidase subunits, gp91phox, p47phox, and rac-1. Both RAGE and RAGE ligands, including S100A8/A9, high mobility group box 1 (HMGB1), and the advanced glycation end product (AGE) carboxymethyllysine were increased in plaques from diabetic apoE(-/-) mice. Furthermore, the accumulation of AGEs and other ligands to RAGE was reduced in diabetic RAGE(-/-)/apoE(-/-) mice.This study provides evidence for RAGE playing a central role in the development of accelerated atherosclerosis associated with diabetes. These findings emphasize the potential utility of strategies targeting RAGE activation in the prevention and treatment of diabetic macrovascular complications.

OBJECTIVE—Excessive production of reactive oxygen species (ROS) via NADPH oxidase has been implicated in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Since NADPH oxidase activation is closely linked to other putative pathways, its interaction with changes in protein kinase C (PKC) and increased advanced glycation was examined. RESEARCH DESIGN AND METHODS—Streptozotocin-induced diabetic or nondiabetic Sprague Dawley rats were followed for 32 weeks, with groups randomized to no treatment or the NADPH oxidase assembly inhibitor apocynin (15 mg · kg−1 · day−1; weeks 16–32). Complementary in vitro studies were performed in which primary rat mesangial cells, in the presence and absence of advanced glycation end products (AGEs)-BSA, were treated with either apocynin or the PKC-α inhibitor Ro-32-0432. RESULTS—Apocynin attenuated diabetes-associated increases in albuminuria and glomerulosclerosis. Circulating, renal cytosolic, and skin collagen–associated AGE levels in diabetic rats were not reduced by apocynin. Diabetes-induced translocation of PKC, specifically PKC-α to renal membranes, was associated with increased NADPH-dependent superoxide production and elevated renal, serum, and urinary vascular endothelial growth factor (VEGF) concentrations. In both diabetic rodents and in AGE-treated mesangial cells, blockade of NADPH oxidase or PKC-α attenuated cytosolic superoxide and PKC activation and increased VEGF. Finally, renal extracellular matrix accumulation of fibronectin and collagen IV was decreased by apocynin. CONCLUSIONS—In the context of these and previous findings by our group, we conclude that activation of NADPH oxidase via phosphorylation of PKC-α is downstream of the AGE–receptor for AGE interaction in diabetic renal disease and may provide a novel therapeutic target for diabetic nephropathy.

The accumulation of advanced glycation end products (AGEs) have been implicated in the development and progression of diabetic kidney disease (DKD). There has been interest in investigating the potential of AGE clearance receptors, such as oligosaccharyltransferase-48kDa subunit (OST48) to prevent the detrimental effects of excess AGE accumulation seen in the diabetic kidney. Here the objective of the study was to increase the expression of OST48 to examine if this slowed the development of DKD by facilitating the clearance of AGEs. Groups of 8-week-old heterozygous knock-in male mice (n=9-12/group) over-expressing the gene encoding for OST48, dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase (DDOST+/-) and litter mate controls were randomised to either (i) no diabetes or (ii) diabetes induced via multiple low-dose streptozotocin and followed for 24 weeks. By the study end, global over expression of OST48 increased glomerular OST48. This facilitated greater renal excretion of AGEs but did not affect circulating or renal AGE concentrations. Diabetes resulted in kidney damage including lower glomerular filtration rate, albuminuria, glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis. In diabetic mice, tubulointerstitial fibrosis was further exacerbated by global increases in OST48. There was significantly insulin effectiveness, increased acute insulin secretion, fasting insulin concentrations and AUCinsulin observed during glucose tolerance testing in diabetic mice with global elevations in OST48 when compared to diabetic wild-type littermates. Overall, this study suggested that despite facilitating urinary-renal AGE clearance, there were no benefits observed on kidney functional and structural parameters in diabetes afforded by globally increasing OST48 expression. However, the improvements in insulin secretion seen in diabetic mice with global over-expression of OST48 and their dissociation from effects on kidney function warrant future investigation.

The accumulation of advanced glycation end products is implicated in the development and progression of diabetic kidney disease. No study has examined whether stimulating advanced glycation clearance via receptor manipulation is reno-protective in diabetes. Podocytes, which are early contributors to diabetic kidney disease and could be a target for reno-protection. To examine the effects of increased podocyte oligosaccharyltransferase-48 on kidney function, glomerular sclerosis, tubulointerstitial fibrosis and proteome (PXD011434), we generated a mouse with increased oligosaccharyltransferase-48kDa subunit abundance in podocytes driven by the podocin promoter. Despite increased urinary clearance of advanced glycation end products, we observed a decline in renal function, significant glomerular damage including glomerulosclerosis, collagen IV deposition, glomerular basement membrane thickening and foot process effacement and tubulointerstitial fibrosis. Analysis of isolated glomeruli identified enrichment in proteins associated with collagen deposition, endoplasmic reticulum stress and oxidative stress. Ultra-resolution microscopy of podocytes revealed denudation of foot processes where there was co-localization of oligosaccharyltransferase-48kDa subunit and advanced glycation end-products. These studies indicate that increased podocyte expression of oligosaccharyltransferase-48kDa subunit results in glomerular endoplasmic reticulum stress and a decline in kidney function.