Myosin II is the main force generating motor during muscle contraction. Myosin II exists as different isoforms, involved in diverse physiological functions. The outstanding question is whether the myosin heavy chain (MHC) isoforms alone account for the distinct physiological properties. Unique sets of essential and regulatory light chains (RLCs) assembled with specific MHCs raises an interesting possibility of specialization of myosin functions via light chains (LCs). Here, we ask whether different RLCs contribute to the functional diversification. To investigate this, we generated chimeric motors by reconstituting MHC fast isoform (MyHC-IId) and slow isoform (MHC-I) with different light chain variants. As a result of RLCs swapping, actin filament sliding velocity increased by nearly 10 fold for the slow myosin and decreased by >3 fold for the fast myosin. Ensemble molecule solution kinetics and single-molecule optical trapping measurements provided in-depth insights into altered chemo-mechanical properties of the myosin motors, thereby affecting the sliding speed. We find that both slow and fast myosins mechanical output is sensitive to the RLC isoform and propose that RLCs are crucial in fine-tuning of the myosin function.

Though myosins share a structurally conserved motor domain, single amino acid variations of active site elements, including the P-loop, switch-1 and switch-2, which act as nucleotide sensors, can substantially determine the kinetic signature of a myosin, i.e ., to either perform fast movement or enable long-range transport and tension generation. Switch-2 essentially contributes to the ATP hydrolysis reaction and determines product release. With few exceptions, class-1 myosin harbor a tyrosine in the switch-2 consensus sequence DIYGFE, at a position where class-2 myosins and a selection of myosins from other classes have a substitution. Here, we addressed the role of the tyrosine in switch-2 of class-1 myosins as potential determinant of the duty ratio. We generated constitutively active motor domain constructs of two class-1 myosins from the social amoeba Dictyostelium discoideum , namely, Myo1E, a high duty ratio myosin and Myo1B, a low duty ratio myosin. In Myo1E we introduced mutation Y388F and in Myo1B mutation F387Y. The detailed functional characterization by steady-state and transient kinetic experiments, combined with in vitro motility and landing assays revealed an almost reciprocal relationship of a number of critical kinetic parameters and equilibrium constants between wild-type and mutants that dictate the lifetime of the strongly actin-attached states of myosin. The Y-to-F mutation increased the duty ratio of Moy1B by almost one order of magnitude, while the introduction of the phenylalanine in switch-2 of Myo1E transformed the myosin into a low duty ratio motor. These data together with structural considerations propose a role of switch-2 in fine-tuning ADP release through a mechanism, where the class-specific tyrosine together with surrounding residues contributes to the coordination of Mg 2+ and ADP. Our results highlight the importance of conserved switch-2 residues in class-1 myosins for efficient chemo-mechanical coupling, revealing that switch-2 is important to adjust the duty ratio of the amoeboid class-1 myosins for performing movement, transport or gating functions.

Abstract The role of cyclic adenosine monophosphate (3’,5’-cAMP) in plants is not well understood, and here, we report a novel role of 3’,5’-cAMP in regulating the actin cytoskeleton. The 3’,5’-cAMP treatment affects the thermal stability of 51 proteins, including a vegetative actin isoform, ACTIN2. Consistent with the above results, the increase in 3’,5’-cAMP levels, obtained either by feeding or by chemical modulation of 3’,5’-cAMP metabolism, is sufficient to partially rescue the short hypocotyl phenotype of the actin2 actin7 mutant, severely compromised in actin level. No such complementation was measured for a positional isomer of 3’,5’-cAMP, 2’,3’-cAMP, attesting to the specificity of 3’,5’-cAMP treatment. Moreover, supplementation of 3’,5’-cAMP partly counters the activity of an actin-depolymerizing drug latrunculin B. In vitro characterization of the 3’,5’-cAMP – actin interaction argues against the direct binding. Instead, based on the proteomics characterization of the act2act7 mutant supplemented with 3’,5’-cAMP, we hypothesize that 3’,5’-cAMP affects cytoskeleton dynamic by modulation of calcium signaling, and actin binding proteins.

Abstract Aberrant Ras homologous (Rho) GTPase signalling is a major driver of cancer metastasis, and GTPase-activating proteins (GAPs), the negative regulators of RhoGTPases, are considered promising targets for suppressing metastasis, yet drug discovery efforts have remained elusive. Here, we report the identification and characterization of adhibin, a synthetic allosteric inhibitor of RhoGAP class-IX myosins that abrogates ATPase and motor function, suppressing RhoGTPase-mediated modes of cancer cell metastasis. In human and murine adenocarcinoma and melanoma cell models, including three-dimensional spheroid cultures, we reveal anti-migratory and anti-adhesive properties of adhibin that originate from local disturbances in RhoA/ROCK-regulated signalling, affecting actin-dynamics and actomyosin-based cell-contractility. Adhibin blocks membrane protrusion formation, disturbs remodelling of cell-matrix adhesions, affects contractile ring formation, and disrupts epithelial junction stability; processes severely impairing single/collective cell migration and cytokinesis. Combined with the non-toxic, non-pathological signatures of adhibin validated in organoids, mouse and Drosophila models, this mechanism of action provides the basis for developing anti-metastatic cancer therapies.