Abstract Jasmonates (JAs) trigger an important transcriptional reprogramming of plant cells to modulate both basal development and stress responses. In spite of the importance of transcriptional regulation, only one transcription factor (TF), the Arabidopsis thaliana basic helix-loop-helix MYC2, has been described so far as a direct target of JAZ repressors. By means of yeast two-hybrid screening and tandem affinity purification strategies, we identified two previously unknown targets of JAZ repressors, the TFs MYC3 and MYC4, phylogenetically closely related to MYC2. We show that MYC3 and MYC4 interact in vitro and in vivo with JAZ repressors and also form homo- and heterodimers with MYC2 and among themselves. They both are nuclear proteins that bind DNA with sequence specificity similar to that of MYC2. Loss-of-function mutations in any of these two TFs impair full responsiveness to JA and enhance the JA insensitivity of myc2 mutants. Moreover, the triple mutant myc2 myc3 myc4 is as impaired as coi1-1 in the activation of several, but not all, JA-mediated responses such as the defense against bacterial pathogens and insect herbivory. Our results show that MYC3 and MYC4 are activators of JA-regulated programs that act additively with MYC2 to regulate specifically different subsets of the JA-dependent transcriptional response.

Abstract Arabidopsis thaliana plants fend off insect attack by constitutive and inducible production of toxic metabolites, such as glucosinolates (GSs). A triple mutant lacking MYC2, MYC3, and MYC4, three basic helix-loop-helix transcription factors that are known to additively control jasmonate-related defense responses, was shown to have a highly reduced expression of GS biosynthesis genes. The myc2 myc3 myc4 (myc234) triple mutant was almost completely devoid of GS and was extremely susceptible to the generalist herbivore Spodoptera littoralis. On the contrary, the specialist Pieris brassicae was unaffected by the presence of GS and preferred to feed on wild-type plants. In addition, lack of GS in myc234 drastically modified S. littoralis feeding behavior. Surprisingly, the expression of MYB factors known to regulate GS biosynthesis genes was not altered in myc234, suggesting that MYC2/MYC3/MYC4 are necessary for direct transcriptional activation of GS biosynthesis genes. To support this, chromatin immunoprecipitation analysis showed that MYC2 binds directly to the promoter of several GS biosynthesis genes in vivo. Furthermore, yeast two-hybrid and pull-down experiments indicated that MYC2/MYC3/MYC4 interact directly with GS-related MYBs. This specific MYC–MYB interaction plays a crucial role in the regulation of defense secondary metabolite production and underlines the importance of GS in shaping plant interactions with adapted and nonadapted herbivores.

SUMMARY Catharanthus roseus produces a diverse range of specialized metabolites of the monoterpenoid indole alkaloid (MIA) class in a heavily branched pathway. Recent great progress in identification of MIA biosynthesis genes revealed that the different pathway branch genes are expressed in a highly cell type- and organ-specific and stress-dependent manner. This implies a complex control by specific transcription factors (TFs), only partly revealed today. We generated and mined a comprehensive compendium of publicly available C. roseus transcriptome data for MIA pathway branch-specific TFs. Functional analysis was performed through extensive comparative gene expression analysis and profiling of over 40 MIA metabolites in the C. roseus flower petal expression system. We identified additional members of the known BIS and ORCA regulators. Further detailed study of the ORCA TFs suggests subfunctionalization of ORCA paralogs in terms of target gene-specific regulation and synergistic activity with the central jasmonate response regulator MYC2. Moreover, we identified specific amino acid residues within the ORCA DNA-binding domains that contribute to the differential regulation of some MIA pathway branches. Our results advance our understanding of TF paralog specificity for which, despite the common occurrence of closely related paralogs in many species, comparative studies are scarce. SIGNIFICANCE STATEMENT A gene discovery program for regulators of monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus advances our understanding of paralog specificity and subfunctionalization of the renowned class of ORCA transcription factors, particularly in terms of target gene-specificity and synergistic activity with other jasmonate-responsive transcription factors.

Jasmonate (JA) synthesis and signaling are essential for plant defense upregulation upon herbivore or microbial attacks. Stress-induced accumulation of jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile), the bioactive hormonal form triggering major transcriptional changes, is often dynamic and transient, due to the existence of potent removal mechanisms. Two distinct but interconnected JA-Ile turnover pathways have been described in Arabidopsis, either via cytochrome P450 (CYP94)-mediated oxidation, or through deconjugation by the amidohydrolases (AH) IAR3 and ILL6. Their impact was not well known because of gene redundancy and compensation mechanisms when each pathway was partially impaired. Here we address the consequences of fully blocking either or both pathways on JA homeostasis and defense signaling in three mutant backgrounds: a double iar3 ill6 ( 2ah ) mutant, a triple cyp94b1 b3 c1 mutant ( 3cyp ), and a newly generated quintuple ( 5ko ) mutant deficient in all known JA-Ile-degrading activities. These lines behaved very differently in response to either mechanical wounding, insect attack or fungal infection, highlighting the stress-specific contributions and impacts of JA-Ile catabolic pathways. Deconjugation and oxidative pathways contributed additively to JA-Ile removal upon wounding, but their genetic impairement had opposite impacts on Spodoptera littoralis larvae feeding: 2ah line was more resistant whereas 3cyp was more susceptible to insect attack. In contrast, 2ah, 5ko but not 3cyp overaccumulated JA-Ile upon inoculation by Botrytis cinerea , yet 3cyp was most resistant to the fungus. Despite of building-up unprecedented JA-Ile levels, 5ko displayed near WT levels of resistance in both bioassays. Molecular and metabolic analysis indicated that restrained JA-Ile catabolism resulted in enhanced defense and resistance levels only if genes encoding JAZ or JAM negative regulators were not simultaneously overstimulated. Our data demonstrate that despite of acting on a shared hormonal substrate, AH or/and CYP94 deficiency differentially impacts JA homeostasis, responses and tolerance to related biotic stresses.