ERK signaling requires RAS-induced RAF dimerization and is limited by feedback. Activated BRAF mutants evade feedback inhibition of RAS by either of two mechanisms. BRAF V600 mutants are activated monomers when RAS activity is low; all other activating BRAF mutants function as constitutive RAS-independent dimers. RAF inhibitors effectively inhibit mutant monomers, but not dimers; their binding to one site in the dimer significantly reduces their affinity for the second. Tumors with non-V600E BRAF mutants are insensitive to these drugs, and increased expression of BRAF V600E dimers causes acquired resistance. A compound that equally inhibits both sites of mutant RAF dimers inhibits tumors driven by either class of mutants or those BRAF V600E tumors with dimer-dependent acquired resistance to monomer-specific inhibitors.

Hypoactive BRAF mutants bind more tightly than wild type to the upstream regulator RAS, thus amplifying to amplify ERK signalling; tumours expressing these mutants require coexistent mechanisms for RAS activation to grow and are sensitive to their inhibition. Mutant alleles of the kinase BRAF have been identified in human tumours, some of which have activated catalytic functions, whereas others have impaired or absent kinase activity. Here Neal Rosen and colleagues have characterized the less-understood hypoactive BRAF mutants. They find that these mutants bind more tightly to the upstream regulator RAS in order to amplify signalling and require coexistent mechanisms for RAS activation in the tumour in order to function. The mechanistic action of these hypoactive BRAF mutants is different to that of the activated mutants and dictates their sensitivity to therapeutic inhibitors of the pathway. Elsewhere in this issue, David Santamaria and colleagues show that kinase-inactive BRAF mutants can initiate the development of lung adenocarcinoma in mice. Approximately 200 BRAF mutant alleles have been identified in human tumours. Activating BRAF mutants cause feedback inhibition of GTP-bound RAS, are RAS-independent and signal either as active monomers (class 1) or constitutively active dimers (class 2)1. Here we characterize a third class of BRAF mutants—those that have impaired kinase activity or are kinase-dead. These mutants are sensitive to ERK-mediated feedback and their activation of signalling is RAS-dependent. The mutants bind more tightly than wild-type BRAF to RAS–GTP, and their binding to and activation of wild-type CRAF is enhanced, leading to increased ERK signalling. The model suggests that dysregulation of signalling by these mutants in tumours requires coexistent mechanisms for maintaining RAS activation despite ERK-dependent feedback. Consistent with this hypothesis, melanomas with these class 3 BRAF mutations also harbour RAS mutations or NF1 deletions. By contrast, in lung and colorectal cancers with class 3 BRAF mutants, RAS is typically activated by receptor tyrosine kinase signalling. These tumours are sensitive to the inhibition of RAS activation by inhibitors of receptor tyrosine kinases. We have thus defined three distinct functional classes of BRAF mutants in human tumours. The mutants activate ERK signalling by different mechanisms that dictate their sensitivity to therapeutic inhibitors of the pathway.

Abstract Histiocytic neoplasms are clonal, hematopoietic disorders characterized by an accumulation of abnormal, monocyte-derived dendritic cells or macrophages in Langerhans cell histiocytosis (LCH) and non-Langerhans cell histiocytosis (non-LCH), respectively. The discovery of BRAFV600E mutations in approximately 50% of these patients provided the first molecular therapeutic target in histiocytosis. However, recurrent driving mutations in the majority of patients with BRAFV600E–wild-type non-LCH are unknown, and recurrent cooperating mutations in non-MAP kinase pathways are undefined for the histiocytic neoplasms. Through combined whole-exome and transcriptome sequencing, we identified recurrent kinase fusions involving BRAF, ALK, and NTRK1, as well as recurrent, activating MAP2K1 and ARAF mutations in patients with BRAFV600E–wild-type non-LCH. In addition to MAP kinase pathway lesions, recurrently altered genes involving diverse cellular pathways were identified. Treatment of patients with MAP2K1- and ARAF-mutated non-LCH using MEK and RAF inhibitors, respectively, resulted in clinical efficacy, demonstrating the importance of detecting and targeting diverse kinase alterations in these disorders. Significance: We provide the first description of kinase fusions in systemic histiocytic neoplasms and activating ARAF and MAP2K1 mutations in non-Langerhans histiocytic neoplasms. Refractory patients with MAP2K1- and ARAF-mutant histiocytoses had clinical responses to MEK inhibition and sorafenib, respectively, highlighting the importance of comprehensive genomic analysis of these disorders. Cancer Discov; 6(2); 154–65. ©2015 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 109

Precision medicines exert selective pressure on tumour cells that leads to the preferential growth of resistant subpopulations, necessitating the development of next-generation therapies to treat the evolving cancer. The PIK3CA-AKT-mTOR pathway is one of the most commonly activated pathways in human cancers, which has led to the development of small-molecule inhibitors that target various nodes in the pathway. Among these agents, first-generation mTOR inhibitors (rapalogs) have caused responses in 'N-of-1' cases, and second-generation mTOR kinase inhibitors (TORKi) are currently in clinical trials. Here we sought to delineate the likely resistance mechanisms to existing mTOR inhibitors in human cell lines, as a guide for next-generation therapies. The mechanism of resistance to the TORKi was unusual in that intrinsic kinase activity of mTOR was increased, rather than a direct active-site mutation interfering with drug binding. Indeed, identical drug-resistant mutations have been also identified in drug-naive patients, suggesting that tumours with activating MTOR mutations will be intrinsically resistant to second-generation mTOR inhibitors. We report the development of a new class of mTOR inhibitors that overcomes resistance to existing first- and second-generation inhibitors. The third-generation mTOR inhibitor exploits the unique juxtaposition of two drug-binding pockets to create a bivalent interaction that allows inhibition of these resistant mutants.

The epidermal growth-factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor erlotinib has been proven to be highly effective in the treatment of nonsmall cell lung cancer (NSCLC) harboring oncogenic EGFR mutations. The majority of patients, however, will eventually develop resistance and succumb to the disease. Recent studies have identified secondary mutations in the EGFR (EGFR T790M) and amplification of the N-Methyl-N′-nitro-N-nitroso-guanidine (MNNG) HOS transforming gene (MET) oncogene as two principal mechanisms of acquired resistance. Although they can account for approximately 50% of acquired resistance cases together, in the remaining 50%, the mechanism remains unknown. In NSCLC-derived cell lines and early-stage tumors before erlotinib treatment, we have uncovered the existence of a subpopulation of cells that are intrinsically resistant to erlotinib and display features suggestive of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We showed that activation of TGF-β–mediated signaling was sufficient to induce these phenotypes. In particular, we determined that an increased TGF-β–dependent IL-6 secretion unleashed previously addicted lung tumor cells from their EGFR dependency. Because IL-6 and TGF-β are prominently produced during inflammatory response, we used a mouse model system to determine whether inflammation might impair erlotinib sensitivity. Indeed, induction of inflammation not only stimulated IL-6 secretion but was sufficient to decrease the tumor response to erlotinib. Our data, thus, argue that both tumor cell-autonomous mechanisms and/or activation of the tumor microenvironment could contribute to primary and acquired erlotinib resistance, and as such, treatments based on EGFR inhibition may not be sufficient for the effective treatment of lung-cancer patients harboring mutant EGFR.

Abstract Over 300 BRAF missense mutations have been identified in patients, yet currently approved drugs target V600 mutants alone. Moreover, acquired resistance inevitably emerges, primarily due to RAF lesions that prevent inhibition of BRAF V600 with current treatments. Therefore, there is a need for new therapies that target other mechanisms of activated BRAF. In this study, we use the Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) technology, which promotes ubiquitination and degradation of neo-substrates, to address the limitations of BRAF inhibitor-based therapies. Using vemurafenib-based PROTACs, we successfully achieve sub-nanomolar degradation of all classes of BRAF mutants, but spare degradation of WT RAF family members. Our lead PROTAC outperforms vemurafenib in inhibiting cancer cell growth and shows in vivo efficacy in a Class 2 BRAF xenograft model. Mechanistic studies reveal that BRAF WT is spared due to weak ternary complex formation in cells owing to its quiescent inactivated conformation, and activation of BRAF WT sensitizes it to degradation. This study highlights the degree of selectivity achievable using degradation-based therapies by targeting mutant BRAF-driven cancers while sparing BRAF WT and thus expanding the therapeutic window using a new anti-tumor drug modality.

Abstract Purpose Breast cancer diagnosed within 10 years following childbirth is defined as postpartum breast cancer (PPBC) and is highly metastatic. Interactions between immune cells and other stromal cells within the involuting mammary gland are fundamental in facilitating an aggressive tumor phenotype. The MNK1/2-eIF4E axis promotes the translation of pro-metastatic mRNAs in tumor cells, but its role in modulating the function of non-tumor cells in the PPBC microenvironment, and in particular its activity in human PPBC, has not been explored. Experimental design We used a combination of in vivo PPBC models and in vitro assays to study the effects of phospho-eIF4E deficiency on the pro-tumor function of select cells of the TME. Furthermore, we employed Imaging Mass Cytometry on PPBC and non-PPBC patient samples, to chart the expression of the MNK1/2-eIF4E axis components in the TME. Results Here, we show that phospho-eIF4E deficient (eIF4E S209A ) PPBC mice are protected against lung metastasis and reveal differences in the lung immune microenvironment of the WT and eIF4E S209A mice. Moreover, we show that the expression of fibroblast-derived IL-33, an alarmin known to induce invasion, was repressed upon MNK1/2-eIF4E axis inhibition. Imaging Mass Cytometry results indicated that human PPBC contain phospho-eIF4E high-expressing tumor cells and CD8+ T cells displaying an activated dysfunctional phenotype. Finally, we block lung metastasis in PPBC mice, using combined MNK1/2 inhibition and anti-PD-1 therapy. Conclusions These findings implicate the involvement of the MNK1/2-eIF4E axis during PPBC metastasis and suggest a promising immunomodulatory route to enhance the efficacy of immunotherapy by blocking phospho-eIF4E. Translational relevance Postpartum breast cancer (PPBC) is highly aggressive. It is hypothesized that involution-induced changes in the postpartum breast microenvironment, which include an influx of inflammatory immune cells and activation of resident fibroblasts, facilitate the invasiveness of an existing neoplasm. We used imaging mass cytometry to do an in-depth profiling of the MNK1-eIF4E axis in the TME of a unique cohort of PPBC and non-PPBC patients. We observed patterns of phospho-eIF4E in non-tumor cells that were specific to the TME of PPBC. We also noted that the CD8 + T cells present in PPBC express an activated dysfunctional phenotype characterized by the co-expression of HLA-DR and PD-1. This study represents a first look at the expression of the MNK1-eIF4E axis in the stromal cells of metastatic breast cancer and has therapeutic implications as we show, in an animal model of PPBC, that MNK1/2 inhibition can be used to sensitize tumors to anti-PD1 immunotherapy.

Abstract Melanomas commonly undergo a phenotype switch, from a proliferative to an invasive state. Melanoma plasticity exhibited as phenotype switching contributes to immunotherapy resistance, however the mechanisms are not completely understood and thus therapeutically unexploited. Here, using a transgenic melanoma mouse model, we demonstrated a critical role of the MNK1/2-eIF4E axis in melanoma plasticity and resistance to immunotherapy. We showed that phospho-eIF4E deficient murine melanomas express high levels of melanocytic antigens, with similar results verified in patient melanomas. Mechanistically, we identified that phospho-eIF4E controls the translation of NGFR , a critical effector of phenotype switching. In patients with melanoma, the expression of MKNK1 , the kinase for eIF4E, positively correlated with markers of immune exhaustion. Genetic ablation of phospho-eIF4E reprogrammed the immunosuppressive microenvironment, exemplified by lowered production of inflammatory factors and increased CD8 + T cell infiltrates. Blocking phospho-eIF4E, using MNK1/2 inhibitors, offers a new strategy to inhibit melanoma plasticity and improve the survival response to anti-PD-1 immunotherapy.