We have previously shown that Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells grown in collagen gels in the presence of fibroblasts or fibroblast-conditioned medium (CM) form branching tubules, instead of the spherical cysts that develop under control conditions. We now report that the fibroblast-derived molecule responsible for epithelial tubulogenesis is hepatocyte growth factor (HGF). First, addition of exogenous HGF to cultures of MDCK cells induces formation of epithelial tubules. Second, the tubulogenic activity of fibroblast CM is completely abrogated by antibodies to HGF. These results demonstrate that HGF, a polypeptide that was identified as a mitogen for cultured hepatocytes, has the properties of a paracrine mediator of epithelial morphogenesis, and sugges that it may play important roles in the formation of parenchymal organs during embryonic development.

The embryonic role of endothelial cells and nascent vessels in promoting organogenesis, prior to vascular function, is unclear. We find that early endothelial cells in mouse embryos surround newly specified hepatic endoderm and delimit the mesenchymal domain into which the liver bud grows. In flk-1 mutant embryos, which lack endothelial cells, hepatic specification occurs, but liver morphogenesis fails prior to mesenchyme invasion. We developed an embryo tissue explant system that permits liver bud vasculogenesis and show that in the absence of endothelial cells, or when the latter are inhibited, there is a selective defect in hepatic outgrowth. We conclude that vasculogenic endothelial cells and nascent vessels are critical for the earliest stages of organogenesis, prior to blood vessel function.

Abstract Lung cancer with epidermal growth factor receptor (EGFR)–activating mutations responds favorably to the EGFR tyrosine kinase inhibitors gefitinib and erlotinib. However, 25% to 30% of patients with EGFR-activating mutations show intrinsic resistance, and the responders invariably acquire resistance to gefitinib. Here, we showed that hepatocyte growth factor (HGF), a ligand of MET oncoprotein, induces gefitinib resistance of lung adenocarcinoma cells with EGFR-activating mutations by restoring the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway via phosphorylation of MET, but not EGFR or ErbB3. Strong immunoreactivity for HGF in cancer cells was detected in lung adenocarcinoma patients harboring EGFR-activating mutations, but no T790M mutation or MET amplification, who showed intrinsic or acquired resistance to gefitinib. The findings indicate that HGF-mediated MET activation is a novel mechanism of gefitinib resistance in lung adenocarcinoma with EGFR-activating mutations. Therefore, inhibition of HGF-MET signaling may be a considerable strategy for more successful treatment with gefitinib. [Cancer Res 2008;68(22):9479–87]

Using a rat model of ischemia/reperfusion injury, we demonstrate here that HGF is cardioprotective due to its antiapoptotic effect on cardiomyocytes. Following transient myocardial ischemia and reperfusion, c-Met/HGF receptor expression rapidly increased in the ischemic myocardium, an event accompanied by a dramatic increase in plasma HGF levels in the infarcted rats. When endogenous HGF was neutralized with a specific antibody, the number of myocyte cell deaths increased markedly, the infarct area expanded, and the mortality increased to 50%, as compared with a control group in which there was no mortality. Plasma from the myocardial infarcted rats had cardioprotective effects on primary cultured cardiomyocytes, but these effects were significantly diminished by neutralizing HGF. In contrast, recombinant HGF administration reduced the size of infarct area and improved cardiac function by suppressing apoptosis in cardiomyocytes. HGF rapidly augmented Bcl-xL expression in injured cardiomyocytes both in vitro and in vivo. As apoptosis of cardiomyocytes is one of the major contributors to the pathogenesis in subjects with ischemia/reperfusion injury, prevention of apoptosis may prove to be a reasonable therapeutic strategy. Supplements of HGF, an endogenous cardioprotective factor, may be found clinically suitable in treating subjects with myocardial infarction.

Although acute renal failure is encountered with administration of nephrotoxic drugs, ischemia, or unilateral nephrectomy, there has been no effective drug which can be used in case of acute renal failure. Hepatocyte growth factor (HGF) is a potent hepatotropic factor for liver regeneration and is known to have mitogenic, motogenic, and morphogenic activities for various epithelial cells, including renal tubular cells. Intravenous injection of recombinant human HGF into mice remarkably suppressed increases in blood urea nitrogen and serum creatinine caused by administration of cisplatin, a widely used antitumor drug, or HgCl2, thereby indicating that HGF strongly prevented the onset of acute renal dysfunction. Moreover, exogenous HGF stimulated DNA synthesis of renal tubular cells after renal injuries caused by HgCl2 administration and unilateral nephrectomy and induced reconstruction of the normal renal tissue structure in vivo. Taken together with our previous finding that expression of HGF was rapidly induced after renal injuries, these results allow us to conclude that HGF may be the long-sought renotropic factor for renal regeneration and may prove to be effective treatment for patients with renal dysfunction, especially that caused by cisplatin.

Although clinical trials of stimulation of angiogenesis by transfection of angiogenic growth factors using naked plasmid DNA or adenoviral vector have been successful, there are still unresolved problems for human gene therapy such as low transfection efficiency and safety. From this viewpoint, it is necessary to develop safe and efficient novel nonviral gene transfer methods. As therapeutic ultrasound induces cell membrane permeabilization, ultrasound irradiation might increase the transfection efficiency of naked plasmid DNA into skeletal muscle. Thus, we examined the transfection efficiency of naked plasmid DNA using ultrasound irradiation with echo contrast microbubble (Optison) in vitro and in vivo experiments. First, we examined the feasibility of ultrasound-mediated transfection of naked plasmid DNA into skeletal muscle cells. Luciferase plasmid mixed with or without Optison was transfected into cultured human skeletal muscle cells using ultrasound (1 MHz; 0.4 W2) for 30 s. Interestingly, luciferase activity was markedly increased in cells treated with Optison, while little luciferase activity could be detected without Optison (P < 0.01). Electron microscopy demonstrated the transient formation of holes (less than 5 μM) in the cell surface, which could possibly explain the rapid migration of the transgene into the cells. Next, we studied the in vivo transfection efficiency of naked plasmid DNA using ultrasound with Optison into skeletal muscle. Two days after transfection, luciferase activity in skeletal muscle transfected with Optison using ultrasound was significantly increased about 10-fold as compared with plasmid alone. Successful transfection was also confirmed by β-galactosidase staining. Finally, we examined the feasibility of therapeutic angiogenesis using naked hepatocyte growth factor (HGF) plasmid in a rabbit ischemia model using the ultrasound–Optison method. Five weeks after transfection, the angiographic score and the number of capillary density in rabbits transfected with Optison using ultrasound was significantly increased as compared with HGF plasmid alone (P < 0.01), accompanied by a significant increase in blood flow and blood pressure ratio (P < 0.01). Overall, the ultrasound transfection method with Optison enhanced the transfection efficiency of naked plasmid DNA in vivo as well as in vitro. Transfection of HGF plasmid by the ultrasound-Optison method could be useful for safe clinical gene therapy to treat peripheral arterial disease without a viral vector system.

We have previously reported that T cells bearing T cell receptors (TCRs) of gamma/delta type appear at a relatively early stage of primary infection with Listeria monocytogenes in mice. To characterize the early-appearing gamma/delta T cells during listeriosis, we analyzed the specificity and cytokine production of the gamma/delta T cells in the peritoneal cavity in mice inoculated intraperitoneally with a sublethal dose of L. monocytogenes. The early-appearing gamma/delta T cells, most of which were of CD4-CD8- phenotype, proliferated and secreted IFN-gamma and macrophage chemotactic factor in response to purified protein derivative from Mycobacterium tuberculosis, or recombinant 65-kD heat-shock protein derived from M. bovis but not to heat-killed Listeria. To further elucidate the potential role of the gamma/delta T cells in the host-defense mechanism against primary infection with Listeria, we examined the effects of in vivo administration of monoclonal antibodies (mAbs) against TCR-gamma/delta or TCR-alpha/beta on the bacterial eradication in mice infected with Listeria. Most of alpha/beta T cells or gamma/delta T cells were depleted in the peripheral lymphoid organs at least for 12 d after an intraperitoneal injection of 200 micrograms TCR-alpha/beta mAb or 200 micrograms TCR-gamma/delta mAb, respectively. An exaggerated bacterial multiplication was evident at the early stage of listerial infection in the gamma/delta T cells-depleted mice, whereas the alpha/beta T cell-depleted mice exhibited much the same resistance level as the control mice at this stage although the resistance was severely impaired at the late stage after listerial infection.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)

Abstract Radiotherapy represents a major treatment option for patients with pancreatic cancer, but recent evidence suggests that radiation can promote invasion and metastasis of cancer cells. Interactions between cancer cells and surrounding stromal cells may play an important role in aggressive tumor progression. In the present study, we investigated the invasive phenotype of pancreatic cancer cells in response to coculture with irradiated fibroblasts. Using in vitro invasion assay, we demonstrated that coculture with nonirradiated fibroblasts significantly increased the invasive ability of pancreatic cancer cells and, surprisingly, the increased invasiveness was further accelerated when they were cocultured with irradiated fibroblasts. The hepatocyte growth factor (HGF) secretion from fibroblasts remained unchanged after irradiation, whereas exposure of pancreatic cancer cells to supernatant from irradiated fibroblasts resulted in increased phosphorylation of c-Met (HGF receptor) and mitogen-activated protein kinase activity, possibly or partially via increased expression of c-Met. We also demonstrated that scattering of pancreatic cancer cells was accelerated by the supernatant from irradiated fibroblasts. The enhanced invasiveness of pancreatic cancer cells induced by coculture with irradiated fibroblasts was completely blocked by NK4, a specific antagonist of HGF. These data suggest that invasive potential of certain pancreatic cancer cells is enhanced by soluble mediator(s) released from irradiated fibroblasts possibly through up-regulation of c-Met expression/phosphorylation and mitogen-activated protein kinase activity in pancreatic cancer cells. Our present findings further support the potential use of NK4 during radiotherapy for patients with pancreatic cancer.

Lung cancers with epidermal growth factor receptor (EGFR)-activating mutations show good clinical response to gefitinib and erlotinib, selective tyrosine kinase inhibitors (TKI) to EGFR, but these tumors invariably develop drug resistance. Host stromal cells have been found to have a considerable effect on the behavior of cancer cells. Little is known, however, about the role of host cells on the sensitivity of cancer cells to receptor TKIs. We have therefore assessed the effect of crosstalk between stromal cells and lung cancer cells harboring EGFR mutations on susceptibility to EGFR-TKIs.We evaluated the gefitinib sensitivity of lung cancer cells with EGFR-activating mutations, PC-9 and HCC827, when cocultured with fibroblasts and coinjected into severe combined immunodeficient mice. We also examined the effect of lung cancer cells to fibroblast recruitment.Both human fibroblast cell lines and primary cultured fibroblasts produced various levels of hepatocyte growth factor (HGF). Lung cancer cells markedly recruited fibroblasts. The lung cancer cells became resistant to EGFR-TKIs when cocultured in vitro with HGF-producing fibroblasts and coinjected into severe combined immunodeficient mice. Importantly, combined use of gefitinib plus anti-HGF antibody or the HGF antagonist, NK4, successfully overcame the fibroblast-induced EGFR-TKI resistance both in vitro and in vivo. Colocalization of fibroblasts and HGF was detected in both xenograft tumors in mouse model and lung cancer patient specimens.These findings indicate that crosstalk to stromal fibroblasts plays a critical role in lung cancer resistance to EGFR-TKIs and may be an ideal therapeutic target in lung cancer with EGFR-activating mutations.