Summary Gut microbiota typically occupy habitats with definable limits/borders that are comparable to oceanic islands. The gut therefore can be regarded as an ‘island’ for the assembly of microbial communities within the ‘sea’ of surrounding environments. This study aims to reveal the ecological mechanisms that govern microbiota in the fish gut ‘island’ ecosystem. Taxonomic compositions, phylogenetic diversity, and community turnover across host development were analyzed via the high‐throughput sequencing of 16S rRNA gene amplicons. The results indicate that the Shannon diversity of gut microbiota in the three examined freshwater fish species all significantly decreased with host development, and the dominant bacterial taxa also changed significantly during host development. Null model and phylogenetic‐based mean nearest taxon distance (MNTD) analyses suggest that host gut environmental filtering led to the assembly of microbial communities in the fish gut ‘island’. However, the phylogenetic clustering of local communities and deterministic processes that governed community turnover became less distinct as the fish developed. The observed mechanisms that shaped fish gut microbiota seemed to be mainly shaped by the gut environment and by some other selective changes accompanying the host development process. These findings greatly enhance our understanding of stage‐specific community assembly patterns in the fish gut ecosystem.

Abstract The Gram-positive bacterium Clostridioides difficile is a primary cause of hospital-acquired diarrhea, threatening both immunocompromised and healthy individuals. An important aspect of elucidating mechanisms that drive C. difficile persistence and virulence relies on developing a more complete understanding of sporulation. C. difficile sporulation is the single determinant of transmission and complicates treatment and prevention due to the chemical and physical resilience of spores. Hence, the identification of potentially druggable targets that significantly attenuate sporulation is important. In this report, we describe the impact of the loss of caseinolytic protease P (ClpP) isoforms in C. difficile strain 630 on sporulation phenotypes. Using CRISPR-Cas9 nickase mediated genome editing, stop codons were inserted early in the coding sequence for clpP1 and clpP2 to generate C. difficile mutants that no longer produced ClpP1 or ClpP2. The data show that these genetic modifications lead to altered sporulation phenotypes, germination efficiencies, and cytotoxicity. Comparative proteome profiling of C. difficile 630 WT and clpP mutants reveals potential proteolytic targets of ClpP that are involved in sporulation. These analyses further reveal the potential for preferred co-chaperone interactions for each ClpP isoform. Taken together, our results demonstrate that ClpP, a promising target in other Gram-positive pathogens, holds promise as an anti-sporulation target in C. difficile .

ABSTRACT Sequence differences among the subtypes of Clostridioides difficile toxin TcdB (2,366 amino acids) are broadly distributed across the entire protein, with the notable exception of 76 residues at the protein’s carboxy terminus. This sequence invariable region (SIR) is identical at the DNA and protein level among the TcdB variants, suggesting this string of amino acids has undergone selective pressure to prevent alterations. The functional role of the SIR domain in TcdB has not been determined. Analysis of a recombinantly constructed TcdB mutant lacking the SIR domain did not identify changes in TcdB’s enzymatic or cytopathic activities. To further assess the SIR region, we constructed a C. difficile strain with the final 228 bp deleted from the tcdB gene, resulting in the production of a truncated form of TcdB lacking the SIR (TcdB2 ∆2291–2366 ). Using a combination of approaches, we found in the absence of the SIR sequence TcdB2 ∆2291–2366 retained cytotoxic activity but was not secreted from C. difficile . TcdB2 ∆2291–2366 was not released from the cell under autolytic conditions, indicating the SIR is involved in a more discrete step in toxin escape from the bacterium. Fractionation experiments combined with antibody detection found that TcdB2 ∆2291–2366 accumulates at the cell membrane but is unable to complete steps in secretion beyond this point. These data suggest conservation of the SIR domain across variants of TcdB could be influenced by the sequence’s role in efficient escape of the toxin from C. difficile . IMPORTANCE Clostridioides difficile is a leading cause of antibiotic associated disease in the United States. The primary virulence factors produced by C. difficile are two large glucosylating toxins TcdA and TcdB. To date, several sequence variants of TcdB have been identified that differ in various functional properties. Here, we identified a highly conserved region among TcdB subtypes that is required for release of the toxin from C. difficile . This study reveals a putative role for the longest stretch of invariable sequence among TcdB subtypes and provides new details regarding toxin release into the extracellular environment. Improving our understanding of the functional roles of the conserved regions of TcdB variants aids in the development of new, broadly applicable strategies to treat CDI.

Riboswitches are cis -acting RNA regulatory elements that control expression of a downstream gene(s) by directly binding to a specific metabolite. Here we report a S-adenosylmethionine (SAM)-I riboswitch in the sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) that plays an additional regulatory role as a trans small noncoding RNA (sRNA) targeting the methionine biosynthesis cycle transcriptional regulator SahR. Sequence and expression analyses indicated that DseA ( Desulfovibrio SAM element A) is located upstream of a small hypothetical protein DVU1170 and that the two are co-transcribed. Multiple techniques were used to verify the riboswitch activity of DseA and its activity as a transcriptional terminator in response to SAM. While determining a potential role for DseA in the methionine biosynthesis pathway, a mRNA target encoding SahR was identified. Subsequent electrophoretic mobility shift assays confirmed the ability of DseA to bind the sahR transcript and qRT-PCR analysis of a DseA deletion strain suggested a negative regulatory role. This study presents the first regulatory role for a newly discovered sRNA in Desulfovibrio . Additionally, this study suggests that DseA acts not only as a riboswitch, but also as a trans regulatory molecule.