Summary Background Correction of von Willebrand factor (VWF) deficiency with replacement products containing VWF can lead to the development of anti-VWF alloantibodies (i.e., VWF inhibitors) in patients with severe von Willebrand disease (VWD). Objective Locate inhibitor-reactive regions within VWF using phage display. Methods We screened a phage library displaying random, overlapping fragments covering the full length VWF protein sequence for binding to a commercial anti-VWF antibody or to immunoglobulins from three type 3 VWD patients who developed VWF inhibitors in response to treatment with plasma-derived VWF. Immunoreactive phage clones were identified and quantified by next generation DNA sequencing (NGS). Results NGS markedly increased the number of phage analyzed for locating immunoreactive regions within VWF following a single round of selection and identified regions not recognized in previous reports using standard phage display methods. Extending this approach to characterize VWF inhibitors from three type 3 VWD patients (including two siblings homozygous for the same VWF gene deletion) revealed patterns of immunoreactivity distinct from the commercial antibody and between unrelated patients, though with notable areas of overlap. Alloantibody reactivity against the VWF propeptide is consistent with incomplete removal of the propeptide from plasma-derived VWF replacement products. Conclusion These results demonstrate the utility of phage display and NGS to characterize diverse anti-VWF antibody reactivities.

Endothelial cells (ECs) are highly specialized across vascular beds. However, given their interspersed anatomic distribution, comprehensive characterization of the molecular basis for this heterogeneity in vivo has been limited. By applying endothelial-specific translating ribosome affinity purification (EC-TRAP) combined with high-throughput RNA sequencing analysis, we identified pan EC-enriched genes and tissue-specific EC transcripts, which include both established markers and genes previously unappreciated for their presence in ECs. In addition, EC-TRAP limits changes in gene expression following EC isolation and in vitro expansion, as well as rapid vascular bed-specific shifts in EC gene expression profiles as a result of the enzymatic tissue dissociation required to generate single cell suspensions for fluorescence-activated cell sorting (FACS) or single cell RNA sequencing analysis. Comparison of our EC-TRAP to published single cell RNA sequencing data further demonstrates considerably greater sensitivity of EC-TRAP for the detection of low abundant transcripts. Application of EC-TRAP to examine the in vivo host response to lipopolysaccharide (LPS) revealed the induction of gene expression programs associated with a native defense response, with marked differences across vascular beds. Furthermore, comparative analysis of whole tissue and TRAP-selected mRNAs identified LPS-induced differences that would not have been detected by whole tissue analysis alone. Together, these data provide a resource for the analysis of EC-specific gene expression programs across heterogeneous vascular beds under both physiologic and pathologic conditions.

ABSTRACT Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), a member of the serine protease inhibitor (SERPIN) superfamily of proteins, is unique among SERPINs for exhibiting a spontaneous conformational change to a latent or inactive state. The functional half-life for this transition at physiologic temperature and pH is ~1-2 h. To better understand the molecular mechanisms underlying this transition, we now report on the analysis of a comprehensive PAI-1 variant library expressed on filamentous phage and selected for functional stability after 48 h at 37 °C. Of the 7,201 possible single amino acid substitutions in PAI-1, we identify 439 that increase the functional stability of PAI-1 beyond that of the wild-type protein and 1,549 that retain inhibitory activity toward PAI-1’s canonical target protease (urokinase-like plasminogen activator, uPA), while exhibiting functional stability less than or equal to that of wild-type PAI-1. Missense mutations that increase PAI-1 functional stability are concentrated in highly flexible regions within the PAI-1 structure. Finally, we developed a method for simultaneously measuring the functional half-lives of hundreds of PAI-1 variants in a multiplexed, massively parallel manner, quantifying the functional half-lives for 697 single missense variants of PAI-1 by this approach. Overall, these findings provide novel insight into the mechanisms underlying PAI-1’s latency transition and provide a database for interpreting human PAI-1 genetic variants.

ABSTRACT The serine protease inhibitor (SERPIN) plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a key regulator of the fibrinolytic system, inhibiting the serine proteases tissue- and urokinase-type plasminogen activator (tPA and uPA, respectively). Missense variants may render PAI-1 non-functional through misfolding, leading to its turnover as a protease substrate, or to a more rapid transition to the latent/inactive state. Deep mutational scanning was performed to evaluate the impact of amino acid sequence variation on PAI-1 inhibition of uPA using an M13 filamentous phage display system. The effects of single amino acid substitutions on PAI-1’s functional inhibition of its canonical target proteases, tPA and uPA, have been determined for only a small fraction of potential mutations. To construct a more comprehensive dataset, a mutagenized PAI-1 library, encompassing ∼70% of potential single amino acid substitutions, was displayed on M13 filamentous phage. From this library, the relative effects of 27% of all possible missense variants on PAI-1 inhibition of urokinase-type plasminogen activator were determined using high-throughput DNA sequencing with 826 missense variants demonstrating conserved inhibitory activity and 1137 resulting in loss of PAI-1 function. Comparison of these deep mutational scanning results to predictions from PolyPhen-2 and SIFT demonstrate the limitations of these algorithms, consistent with similar reports for other proteins. Comparison to common human PAI-1 gene variants present in the gnomAD database is consistent with evolutionary selection against loss of PAI-1 function. These findings provide insight into structure-function relationships for PAI-1 and other members of the SERPIN superfamily.

Normally, von Willebrand factor (VWF) remains inactive unless its A1A2 domains undergo a shear stress-triggered conformational change. We demonstrated the capacity of a recombinant A2 domain of VWF to bind and to affect fibrin formation, altering the fibrin clot structure. The data indicated that VWF contains an additional binding site for fibrin in the A2 domain that plays a role in the incorporation of VWF to the polymerizing fibrin. This study is to examine the hypothesis that active plasma VWF directly influence fibrin polymerization and the structure of fibrin clots. The study used healthy and type 3 von Willebrand disease (VWD) plasma, purified plasma VWF, fibrin polymerization assays, confocal microscopy and scanning electron microscopy. The exposed A2 domain in active VWF harbors additional binding sites for fibrinogen, and significantly potentiates fibrin formation ( P < 0.02). Antibody against the A2 domain of VWF significantly decreased the initial rate of change of fibrin formation ( P < 0.002). Clot analyses revealed a significant difference in porosity between normal and type 3 VWD plasma ( P < 0.008), further supported by scanning electron microscopy, which demonstrated thicker fibrin fibers in the presence of plasma VWF ( P < 0.0003). Confocal immunofluorescence microscopy showed punctate VWF staining along fibrin fibrils, providing visual evidence of the integration of plasma VWF into the fibrin matrix. The study with type 3 VWD plasma supports the hypothesis that plasma VWF directly influences fibrin polymerization and clot structure. In addition, a conformational change in the A1A2 domains exposes a hidden fibrin(ogen) binding site, indicating that plasma VWF determines the fibrin clot structure.